DNA 條形碼技術在淀粉摻假鑒別中的應用

陳 佳，王 爽，周 巍，張 巖,*，桑亞新,*

（1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000；2.山東省標準化研究院，山東 濟南 250000；3.河北省食品檢驗研究院 河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050071）

淀粉是現代食品加工業中一種重要的生產原料，也可以作為一種重要的工業原料用于膠黏、填充等途徑中[1]。目前常見的淀粉種類有馬鈴薯淀粉、番薯淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、麥類淀粉等。其超微形態、糊化溫度等理化性質存在一定的差異，原材料成本及加工工藝的不同也造成了價格大有差別[2-5]。隨著淀粉加工、深加工產品的豐富，淀粉偽造或摻假問題日益突出。目前市場上發現的摻假淀粉總體分為兩類，一類是在淀粉及淀粉制品中摻入滑石粉、白陶土、非食用色素等雜質以次充好，一類是摻入價格較低廉的植物淀粉投機銷售，如在馬鈴薯淀粉中摻入玉米[6]、苜蓿、蕎麥等。雖然后者的摻假現象等不會對人體健康造成嚴重影響，但理化性質的差異會影響食品的成色、品質，并且冒充高價格的淀粉銷往市場謀取非法利潤，嚴重擾亂市場秩序，對合法生產者和消費者來說都是一種損害。

因此，加強對淀粉及其制品的鑒別檢驗極為重要。淀粉的檢測主要由感官指標、理化指標和衛生指標3 項綜合指標組成[1]。感官檢測方法簡單但檢測結果僅能作為輔助參考。理化檢測耗時費力，并且對于第2類摻假問題難以準確鑒別。目前對淀粉摻假研究的檢測方法有掃描電鏡、穩定碳同位素比質譜技術[7]、碘試劑顯色反應等。準確判定淀粉摻假，確保食品標簽制度的有效實施，需要靈敏、可靠的檢測方法鑒定植物源食品的物種來源。

DNA條形碼技術基本原理是利用標準的、具有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段在種內的特異性和種間多樣性，實現對物種的快速自動鑒定[8-10]。目前該技術在植物領域的研究和應用稍落后于動物類群的研究[11-17]，植物DNA條形碼的選擇及評價缺乏統一的標準。目前植物領域DNA條形碼候選片段主要集中于葉綠體和核糖體中，主要包括成熟酶K蛋白（maturase K protein，matK）、質體trnH-psbA間隔區、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶（ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase，rbcL）、核糖體內轉錄間隔區（internal transcribed spacers，ITS）等其他單片段[9,18-19]。但大量研究結果表明，單一片段的植物DNA條形碼存在一定局限性而分辨率較低，因此有研究[20-21]提出植物條形碼片段組合理念，利用優勢互補提高植物種類的鑒定識別率。研究表明陸地植物中較為可行的組合是rbcL（科級）＋matK（屬級）＋ITS和trnH-psbA（種級）[8]。目前國內對于DNA條形碼技術的研究重要集中在單一科屬動植物的分類鑒定[22-23]，對于食品摻假鑒定的相關文獻較少[24-25]，尤其是植物性食品摻假鑒定方面鮮有報道。

本研究使用ITS2、rbcL、matK、trnH-psbA序列的通用引物對苜蓿、馬鈴薯、木薯、番薯、玉米5大淀粉原物種進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增和測序比對，比較各序列的擴增效率和測序成功率，評價不同DNA條形碼候選序列對淀粉原物種的鑒別能力，篩選出較適合的DNA條形碼組合，并對市售淀粉及粉條制品進行物種鑒定和摻假判定，為植物DNA條形碼技術在植物源食品的檢測技術提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

研究用樣本主要選擇淀粉加工類品種，苜蓿（青海苜蓿、本草苜蓿）、馬鈴薯（系薯1號、安薯56號、晉薯5號）、木薯（華南7號、華南8號、面包木薯）、番薯（商薯9號、漯薯10號、徐薯32號、渝薯17號）、玉米（良玉99、登海6702、中單909）由河北農業大學提供，待測樣本5 種淀粉、4 種粉條制品均為市購。

植物基因組DNA提取試劑盒、PremixTaq、Marker（1 000 bp） 寶生物工程（大連）有限公司；GelRed、瓊脂糖 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

LX-100手掌型離心機 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DYY-III2穩壓穩流電泳儀 北京六一儀器廠；BS-124S分析天平 北京賽馬利斯公司；紫外凝膠成像系統、S1000 thermal cycler基因擴增儀 美國伯樂公司；1-15pk冷凍離心機 德國Sigma公司；NanoDrop 1000微量核算蛋白測定儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

陽性樣本及待測樣本基因組DNA提取均采用植物基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒使用手說明書進行基因組DNA提取。

1.3.2 PCR擴增

PCR擴增所用通用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列見表1。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

PCR體系（50 μL）：模板DNA 5 μL；PremixTaq25 μL；正向引物（10 μmol/L）2 μL；反向引物（10 μmol/L）2 μL；無菌水定容到50 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性 30 s，54～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，反應36 個循環；72 ℃延伸10 min。

PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用凝膠成像系統分析擴增產物。

1.3.3 PCR產物測序及比對

PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序，測序引物同于擴增引物。所得的測序結果經拼接并刪除兩端引物序列，提交GenBank進行BLAST比對。

1.3.4 引物通用性驗證

將苜蓿、馬鈴薯、木薯、番薯、玉米分別按照1.3.1節進行基因組DNA提取，經PCR擴增和產物測序比對后驗證選擇引物對的通用性。

2 結果與分析

2.1 DNA條形碼序列片段的擴增

提取苜蓿、馬鈴薯、木薯、番薯、玉米5大物種基因組DNA，分別以ITS2、matK、rbcL和trnH-psbA通用引物進行PCR擴增，并以無菌水作為模板進行陰性對照。擴增產物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所示。綜合分析，ITS2和trnH-psbA擴增效率較高，在陽性樣本的苜蓿、馬鈴薯、木薯、番薯和玉米中均擴增出清晰的條帶。ITS2序列擴增條帶大小在500 bp左右，其中在馬鈴薯中還擴增出700 bp左右大小的非特異條帶。trnH-psbA在苜蓿、馬鈴薯、木薯中擴增出600 bp大小的條帶，而在番薯和玉米中分別得到300 bp和700 bp大小的條帶，擴增條帶大小差異顯著。matK序列引物的通用性較差，僅在馬鈴薯和紅薯中擴增出條帶，其中馬鈴薯中的條帶較弱，擴增效果較差。而rbcL序列通用引物在苜蓿和番薯中呈現清晰單一的擴增條帶，在馬鈴薯擴增結果中有非特異的較大片段，而在木薯中擴增效率較低。

圖1 陽性樣品4 種基因片段的PCR擴增電泳圖Fig. 1 Electrophoresis patterns of 4 genes amplified by PCR frompositive samples

2.2 PCR產物測序成功率

將PCR擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司雙向測序，測序結果提交GenBank進行BLAST比對分析，結果如表2所示。ITS2基因分別在苜蓿、番薯和玉米樣品中比對成功，而在馬鈴薯樣品中比對結果為番茄，且相似率僅為80%，物種特異性較差。matK基因分別在馬鈴薯和番薯樣品中擴增出條帶，但在馬鈴薯樣品中擴增條帶較弱，比對失敗，而在番薯中比對成功，相似率為99%。rbcL基因對馬鈴薯和番薯的靈敏性較高，而在苜蓿中未得到理想比對結果。trnH-psbA基因的測序成功率較高，在苜蓿、馬鈴薯、木薯、番薯中均比對成功，但在玉米樣品中比對結果為束尾草屬植物。

表2 不同DNA序列GenBank數據庫比對鑒定結果Table 2 Results of sequencing and identification in alignment with GenBank

為進一步對DNA條形碼序列進行評價和篩選，對4 個DNA序列的PCR擴增效率（呈現清晰條帶即為判定成功）、測序成功率（測序比對成功）及序列有效獲得率（PCR擴增效率×測序成功率）進行統計，統計結果如表3所示。結果顯示，ITS2和trnH-psbA的序列有效獲得率較高，分別為60%和80%，而matK和rbcL片段的有效率僅為8%和24%。盡管統計樣本容量較小，但統計結果仍為淀粉檢驗DNA條形碼的有效選取提供一定的指導和參考。綜上分析，ITS2和trnH-psbA基因組合可作為候選基因片段進行后續實驗。

表3 不同DNA序列PCR擴增及測序效率Table 3 Results of PCR amplification and sequencing by using different DNA sequences

2.3 引物通用性驗證結果

為進一步驗證本研究獲得的ITS2和trnH-psbA引物組合通用性，對苜蓿（青海苜蓿、本草苜蓿）、馬鈴薯（系薯1號、安薯56號、晉薯5號）、木薯（華南7號、華南8號、面包木薯）、番薯（商薯9號、漯薯10號、徐薯32號、渝薯17號）、玉米（良玉99、登海6702、中單909）進行DNA條形碼的引物驗證。由表4可知，苜蓿、番薯、玉米3 個物種的不同品種均能通過ITS2引物擴增并完成比對鑒定，苜蓿、馬鈴薯、木薯、番薯4 個物種的不同品種均能通過trnH-psbA引物擴增并完成比對鑒定，因此可以說明ITS2和trnH-psbA引物組合的通用性良好。

表4 不同物種GenBank數據庫比對鑒定結果Table 4 Results of sequencing and identification of different plant species in alignment with GenBank

2.4 實際樣品的DNA鑒定

試劑盒法提取抽檢的4 個粉條樣品和5 個淀粉樣品的基因組DNA，分別利用ITS2基因和trnH-psbA基因引物進行PCR擴增，并以無菌水作DNA模板進行陰性對照[26]，擴增結果如圖2所示。陰性對照組無擴增條帶，證明PCR體系未污染。粉條和淀粉樣品均擴增出400～600 bp大小的條帶，且條帶清晰未有雜帶，擴增效率較高。

圖2 待測樣品基因片段的PCR擴增電泳圖Fig. 2 Electrophoresis profiles of genes amplified by PCR from samples

將上述PCR擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序，并將測序結果提交GenBank進行BLAST比對分析，比對結果均為苜蓿屬，結果如表5所示。

表5 抽檢樣品物種鑒定結果Table 5 Species identification of samples

為進一步驗證結果的可靠性，根據苜蓿葉綠體間隔區序列（HQ199041.1）設計苜蓿特異性引物Primer-F：5’-GACGTGTTTCGTAAAG-3’，Primer-R：5’-CTCGAAAAAAGCCTTCT-3’，進行PCR擴增驗證。如表5所示，5 個淀粉樣品和3 個粉條樣品測序比對均為苜蓿，粉條4樣品因PCR擴增效率低未得到結果。綜合分析以上結果，自行購買的粉條和淀粉樣品均摻有苜蓿成分，與樣品包裝標簽成分不符，可判定為摻假樣品。

3 討 論

DNA條形碼技術是當今生物學研究的熱點之一，它操作簡單，不受個體發育階段和形態特征的限制，并可以作為傳統分類學的輔助手段，解決物種鑒定分類等難題[9]。理想的DNA條形碼應符合一些基本標準：1）具有足夠的遺傳變異性和一定的分化度；2）標準的DNA片段；3）包含足夠的系統進化信息；4）便于通用引物設計；5）目標DNA足夠短，便于提取和擴增。雖然DNA條形碼的研究仍存在一定的爭議，但其在動物分類學中的研究已相對成熟，并選取動物細胞色素C氧化酶I基因（coi）作為動物界標準基因[27]。生命條形碼聯盟植物工作組決定將葉綠體中的rbcL和matK兩個基因片段作為植物DNA條形碼核心條碼，核基因的ITS片段和葉綠體中的trnH-psbA片段作為補充條碼[11]。

本研究結果顯示，ITS和trnH-psbA序列有效獲得率較高，并篩選出ITS2和trnH-psbA為較適片段組合，這與前人的研究結果一致。Kress等[18]認為多基因片段組合可實現植物類群的條形碼鑒定，并提出ITS和trnH-psbA是較好的選擇。陳之端等[27]利用rbcL和ITS兩個DNA片段對樺木科6 屬36 種個體取樣分析，建立了樺木科的系統發育，揭示了樺木科屬間系統關系。陳士林等[28-29]在藥用植物中篩選DNA條形碼，發現ITS2在種級水平上的分辨率可以達到92.7%。侯新東等[30]對蕁麻科植物DNA條形碼篩選的研究中發現，trnH-psbA、ITS2、rbcL和matK序列有效獲得率分別為95.4%、92.3%、90.1%和0%，且trnH-psbA、ITS2、rbcL可作為鑒別蕁麻科植物的有效DNA組合。

植物性食源物種種類多且復雜，加工工藝的提高使得植物性制品的原料很難通過形態特征等判定。食品加工制造業的不法商家在加工品中摻雜使假、以次充好，以低價原料冒充高價原料加工銷售，擾亂公平競爭社會風氣，損害消費者和守法生產商的利益。本研究結合ITS2和trnH-psbA組合對抽檢的淀粉和粉條制品進行鑒定，經測序比對發現均摻有苜蓿成分。苜蓿與其他植物源材料相比，價格低廉。雖然摻入的苜蓿成分對人體無害，但其與產品標簽標注不符，存在商業欺詐行為。植物DNA條形碼技術的應用前景廣，但需要DNA條形碼數據庫序列的不斷完善，因此目前DNA條形碼在產品鑒定中的應用較少。本研究為植物DNA條形碼技術的在植物源食品物種鑒定方面的應用提供一定參考。