大葉女貞染色體制片及核型分析

孫 音 ，李兆鵬 ，2，房義福 *，姜楠南 ，王 媛

（1.山東省林業科學研究院，山東 濟南 250014;2.青島農業大學園林與林學院，山東 青島 266109）

大葉女貞 （Ligustrum compactum）別名高桿女貞，木犀科、女貞屬，灌木或小喬木，半常綠[1]。具有重要的園藝和藥用價值，有滯塵抗煙的功能，能吸收二氧化硫,常作行道樹和公園綠化樹種[2]。植物染色體是基因定位、構建物理遺傳圖譜的重要前提，植物染色體研究最常用、最直觀的的方法是染色體制片，鏡檢進行核型分析[3]。染色體核型分析技術可以將染色體逐一識別，對各項穩定特征如染色體的數目、大小、相對長度、著絲點位置、不對稱系數等進行分析，作為植物分類指標被利用[4,5]。同時染色體研究對于基因定位、雜種分析、生物的遺傳機理研究和種族關系鑒定等方面具有重要參考價值[6]。已知木犀科植物染色體基數為x=11-24，但相關的核型分析較少，一方面是由于木本材料的制約，另一方面木犀科植物染色體小、形態不易觀察，制片技術有待于深入研究。目前僅限于幾個屬植物的研究，如木犀屬桂花染色體基數為X=23，核型公式為2n=46=30m+6sm+8st+2t，屬于“2B”類型[7]；白蠟屬絨毛白蠟染色體基數為X=22，核型公式為2n=22=20m+2sm，為“1A”類型[8]；茉莉花屬茉莉染色體基數為X=13,核型公式為2n=26=8m+16sm+2sm，為“3B”類型等[9]。已知女貞屬植物染色體基數為X=23，核型分析還未見報道，而大葉女貞作為女貞屬典型代表，對其進行染色體核型分析，對女貞屬植物系統發育研究和親緣關系鑒定具有重重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料取自2017年濟南市唐王和長清苗圃采收的大葉女貞種子，選擇顆粒飽滿的種子消毒后剝胚放在墊有濕潤脫脂棉的培養皿中，于25℃組培室中萌發。

1.2 方法

1.2.1 染色體制片

分別選取大葉女貞根尖和莖尖[10]為材料，在7:00-12:00時間段內分次取樣，每隔30min取材1次，確定最適宜的取材時間。材料分別經0.02%秋水仙素、0.002mol/L 8-羥基喹啉、飽和對二氯苯、冰水[11,12,13]處理2～8h，2h為一個梯度，確定最適宜的預處理液和預處理時間。預處理后，蒸餾水漂洗2～3遍后于卡諾式固定液中室溫固定24小時。蒸餾水漂洗2-3遍，分別經酶解法和酸解法解離，酸解時間分別為5～25min，5min為一個梯度。酶解法時，選擇有無0.075mol/L KCl低滲液兩組處理，酶解時間分別為90～150min，10min為一個梯度。以確定最適宜的解離方法和時間。解離后，蒸餾水沖洗2～3遍，將材料于載玻片上，濾紙吸干周圍的水分，滴加1～2滴醋酸洋紅或卡寶品紅染液，分別染色5min，15min，25min，以確定最佳染色時間。染色后，運用常規壓片法和改良去壁火焰干燥法制片。

1.2.2 細胞學觀察及數據分析

選取5～10個植株的新生根尖進行核型分析，使用OLYMPUS顯微鏡100倍油鏡進行鏡檢并拍照。運用Adobe Photoshop圖像處理軟件，對分裂中期的大葉女貞染色體進行數據測量并計算染色體組總長度、染色體臂相對長度、臂比、臂指數、不對稱系數等參數[14]。染色體數目的確定和核型分析參照李懋學和陳瑞陽[15]關于植物核型分析標準化建議，參照Levan[16]等的染色體命名規則描述核型公式；按Arano[17]方法計算核不對稱系數；按Kuo[18]等等方法計算相對長度；按Stebbins[19]方法確定染色體類型。

2 結果與分析

2.1 染色體制片的優化

2.1.1 取材部位對制片效果的影響

正常萌動根尖和莖尖為染色體制片常用的取材部位，但實驗結果表明以莖尖為取材部位時，成像不夠清晰，染色體難以計數，而大葉女貞播種苗待胚根長出2～3cm時取樣，所獲得染色體圖像清晰，染色體形態良好，結果穩定，重復性高，見圖1。

圖1 大葉女貞莖尖、根尖及染色體圖像Figure1 The stem apex and the chromosomes

2.1.2 取材時間點對分裂相細胞數的影響

實驗證明上午9:30-10:00是觀察大葉女貞染色體較好的時期，視野中的細胞分裂旺盛，分裂相較多，中期細胞的平均百分比為30%，其它時間段鏡檢也能觀察到分裂中期相，但比例相對較小。

圖2 根尖染色體不同取材時間中期細胞百分比Figure2 The apical chromosomes at 9:00-10:00 and the percentage of the divisition cells in mitosis metaphase at different sampling times

2.1.3 不同預處理液對制片效果的影響

通過對預處理液實驗發現，在8-羥基喹啉、飽和對二氯苯處理2-8h，染色體濃縮程度過高，不利于觀察；選用冰水處理的材料，染色體濃縮程度低，不利于染色體分散和計數；而經秋水仙素處理6h時便于形態觀察和分析，制片效果較好，見圖3。

2.1.4 不同解離液對制片效果的影響

酸解法和酶解法都能獲得較好的染色體中期分裂相，通過對比試驗得出：酶解法時，用1mol/L HCL處理15min效果最佳，見圖4。酶解法時，采用有無KCL低滲液兩個處理，對比試驗發現，低滲過程對女貞染色體制片影響較小，因此為提高實驗效率，省去前后低滲過程，酶解最佳時間為120min～130min。處理時間過短，細胞分散程度低，細胞重疊在一起；而處理時間過長，染色體遭到破壞，斷裂成片段，影響數目統計和分析，表1。

圖3 預處理6h對染色體長度的影響Figure3 Effect of pretreatment 6h on chromosome length

圖4 酸解法解離時間對染色體的影響Figure4 The effect of acid dissociation time on chromosomes

表1 不同解離時間的效果比較Table1 Effect of different dissociation time

用醋酸洋紅和改良石炭酸品紅 （卡寶品紅）染液分別著色，二者染色效果相差不大，且均染色15min為宜，染色時間過短，染色體不能完全著色，成像模糊，難以計數；染色時間過長，視野偏暗，染色體顏色太深，不易觀察。

圖5 染色時間對染色體成像的影響Figure5 The effect of dyeing time on chromosomes

根據上述實驗條件的篩選，于上午10:00選取根尖1mm乳白色部分，秋水仙素預處理6h，卡諾固定液常溫固定24h，1mol/L HCL解離10min，壓片法和火焰干燥法制片。結果表明，兩種制片方法都能獲得良好的染色體分裂相，壓片法制片時，便于鏡檢觀察及拍照，但實驗中，染色體分散效果差，獲得可用于計數及核型分析的細胞概率較低。而用火焰干燥法時，表面張力使染色體自行鋪展，分裂相清晰，同時無染色過程，方便進行染色體后續研究。

2.2 染色體核型分析

鏡檢找到大葉女貞中期分裂相，染色體核型分析數據如表2。大葉女貞染色體總條數為46，基數為23，與早前國外報道的染色體數目一致。核型公式為 2n=2x=46=38+4sm+4st，1號和2號染色體長臂具隨體。中部著絲點（m）染色體19對，近中部著絲點（sm）的染色體2對，近端部著絲點（st）的染色體2對。臂比大于2的染色體有3對，占比為12%，最長染色體與最短染色體長度比為6.35，核型類型屬于Stebbins核型分類中的“2C”型，臂指數為88，核型不對稱系數為60.17%。較不對稱，屬于進化的核型類型。

表2 大葉女貞染色體核型參數Table2 Karyotype parametres of chromosomes of Ligustrum compactum

圖7 大葉女貞染色體核型模式圖Figure7 Karytope pattern of Ligustrum compactum

3 討論

一般來說，能進行細胞分裂的植物組織、細胞等都可以為樣本進行染色體制片[20]。高進紅等[21]利用幼葉獲得了銀杏清晰的染色體標本，陳勁楓等[22]利用卷須獲得了黃瓜、葡萄等植物清晰的染色體圖像，郝愛平和詹亞光等[23]利用植物愈傷組織進行取材并優化了白樺染色體制片。實驗以大葉女貞根尖和莖尖為取材部位，發現莖尖為材料時，細胞易重疊，成像不夠清晰，可能是大葉女貞莖尖分生組織細胞連接結構力大，細胞難以分散。用根尖為實驗材料，制片效果好，且易獲得大量實驗材料，不受外界環境的限制。劉丹[24]認為一天中植物分裂旺盛期一般出現在8:00-11:00，韓毅科[25]在對黃瓜的核型分析中得出8:40-9:10是取材的最佳時間，該實驗得出上午9:00-10:00左右取樣，約30%的細胞處于分裂中期，分裂中期相占比高，與之前報道一致。預處理的目的在于阻止和破壞紡錘體微管形成，使細胞分裂停滯在中期階段，染色體濃縮變短，便于觀察[26]。對二氯苯處理染色體，分散效果好；秋水仙素處理能提高中期分裂相比例；8-羥基喹啉可使染色體及縊痕和次縊痕清晰，適合染色體較大的植物；冰水處理百合科植物的效果較好[27]。但不同植物中作用效果可能有差異，適宜處理時間也不同。大葉女貞經秋水仙素6h處理的染色體形態良好，8-羥基喹啉、飽和對二氯苯處理，染色體濃縮程度高，冰水處理時，染色體之間相互交叉重疊，粘連不分散。說明對于像大葉女貞這種具小染色體且數目相對較多的植物，秋水仙素是較為溫和的預處理液。酸解法步驟簡便，易掌握，壓片后，多呈現單細胞狀態，細胞壁包裹染色體。酶解法溶解細胞壁，原生質體脫離，背景清晰[24]。在大葉女貞染色體制片中，酸解法和酶解法都能獲得良好的制片效果，且為簡化實驗流程，去掉低滲步驟，但解離時間需要嚴格控制。楊寧等對百里香的核型分析中最佳酸解時間為15min[28]；陳晶鑫對梅花核型分析中最佳酶解時間為1h[29]。大葉女貞染色體較小，解離時間不宜太長。改良卡寶品紅適合大多數植物的染色，使染色體著色而細胞質背景清晰，提高了對比度，而醋酸洋紅染液只作臨時鏡檢觀察。材料不同，染色時間也有差異[24]。實驗中兩種染色液染色效果較理想，說明該植物材料較易染色。實驗采用壓片法獲得清晰分裂相，為驗證所試材料的可操作性，同時對火焰干燥法進行改良，酶解省去低滲過程，制片效果好，為以后該方法的使用提高了效率。

實驗得到的大葉女貞染色體數目與之前報道的女貞屬植物一致，核型公式為2n=2x=46=38m+4sm+4st，核型類型屬于Stebbins核型分類中的“2C”型，核型不對稱系數為60.17%。較不對稱，在木犀科報道的幾個屬的植物中，屬于較進化的類型，說明女貞屬植物的起源相對較晚。

本文探討了大葉女貞染色體制片方法，簡化了實驗流程，對女貞屬其它植物的染色體制片提供了技術支持。同時初步分析了大葉女貞的核型類型。但對于染色體顯帶、原位雜交、大葉女貞以及女貞屬在木犀科植物中的進化關系等問題還有待于進一步研究。