氧化石墨烯對鹽脅迫下樹莓組培苗生長及生理特征的影響

薛斌龍，胡曉飛，姚建忠，王海雁，趙建國

（1.山西省桑干河楊樹豐產(chǎn)林實(shí)驗(yàn)局科技服務(wù)中心，山西 大同 037000；2.太原理工大學(xué)材料學(xué)院，山西 太原 030000；3.山西大同大學(xué)化工學(xué)院炭材料研究所，山西 大同037000）

土壤鹽堿化問題日益威脅著人類賴以生存的有限土地資源。鹽堿地是限制植物產(chǎn)量和區(qū)域分布的最主要因素之一。石墨烯具有獨(dú)特的二維結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的力學(xué)性能、熱學(xué)性能和電學(xué)性能、電化學(xué)性能、大比表面積和高透明度等特殊的理化特性[1]，氧化石墨烯是石墨烯的氧化形式。其表面具有豐富的官能團(tuán)，能夠使原本惰性的碳層變得活潑,為各種反應(yīng)的發(fā)生提供了大量表面活性位點(diǎn),提升吸附、催化等化學(xué)反應(yīng)中的活性[2]。氧化石墨烯的獨(dú)特結(jié)構(gòu)及優(yōu)異性質(zhì),在吸附、催化、能儲、過濾、傳感、脫鹽等眾多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[3]。但氧化石墨烯生物效應(yīng)的研究還相對較少，在林業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用的研究尚處于起步階段，至今還未有專門針對其在苗木抗逆性方面影響的研究。

利用整體植物組織研究實(shí)驗(yàn)室內(nèi)培養(yǎng)條件下的鹽脅迫響應(yīng)技術(shù)在植物中已得到應(yīng)用。植物的早期生長是植物對鹽離子響應(yīng)最敏感的階段，相對于器官、組織、細(xì)胞等外植體，整體植物研究可提供更多的研究信息[4]。樹莓(Rubus corchorifoliuslf)是薔薇科懸鉤子屬果樹，多年生落葉小灌木。樹莓酸甜可口，營養(yǎng)豐富，有濃郁的芳香，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值。樹莓適應(yīng)性廣，長勢強(qiáng)，對土質(zhì)無特殊要求，并且可以快速治理荒山，是生態(tài)效益、經(jīng)濟(jì)效益極高的小灌木果樹品種。

此次研究以樹莓組培苗為試驗(yàn)材料，研究了在組培條件下，氧化石墨烯對樹莓組培苗耐鹽能力的影響。以期為逆境條件下氧化石墨烯對林木抗逆性影響提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)，也對促進(jìn)氧化石墨烯在鹽堿化地區(qū)推廣應(yīng)用，加快鹽堿地植被恢復(fù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用山西省楊樹局科技中心組培室保存的樹莓組培苗作為植物材料。樹莓生根培養(yǎng)基使用（1/2MS+0.05 mg·L-1IBA+瓊脂 6g·L-1+糖 28g·L-1PH 值5.8～6.0）。培養(yǎng)室的培養(yǎng)條件為:溫度(25±2)℃;光周期為 14h·d-1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 NaCl脅迫處理

實(shí)驗(yàn)共設(shè)4種處理:(1)對照CK,在生根培養(yǎng)基中不加NaCl和GO;(2)NaCl脅迫,在生根培養(yǎng)基中加入 75mmol·L-1NaCl;(3)NaCl脅迫+GO,在生根培養(yǎng)基中加 75mmol·L-1NaCl和 0.05mg·L-1GO。(4)NaCl脅迫+2mg·L-1GO,在生根培養(yǎng)基中加 75mmol·L-1NaCl和2mg·L-1GO。NaCl和GO在制備基本培養(yǎng)基(MS)時分別加入。除瓊脂為化學(xué)純外,其他所用化學(xué)試劑均為分析純。選取增殖培養(yǎng)健壯且生長一致的組培苗為材料,切割成帶一個腋芽的莖段,轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)試驗(yàn)。單株處理(包括對照)分別接種20瓶，3次重復(fù)。

1.2.2 樹莓形態(tài)學(xué)研究和抗氧化酶活性的測定

NaCl脅迫各處理接種后培養(yǎng)35d脅迫處理之后，記錄根系狀況、植株?duì)顩r。采用LA-S植物圖像分析儀系統(tǒng)對生根組培苗的根系進(jìn)行量化分析。

用于分析植株抗氧化酶活性的材料均為全株,取新鮮樣品,立即放入液氮中冷凍,保存于?80℃冰柜中。用于測定蛋白含量，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶（Catalase CAT）和過氧化物酶(peroxidase，POD)活性。各項(xiàng)生理生化指標(biāo)均重復(fù)測試3次，測定方法參照南京建成公司的相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 NaCl脅迫各處理培養(yǎng)基電導(dǎo)率的變化

Nacl脅迫4種處理（不加瓊脂）各1升，靜置冷卻至室溫，關(guān)閉周圍可產(chǎn)生影響性能振動和電磁干擾的設(shè)備。雷磁DDSJ-308F型電導(dǎo)率儀平行測定6次。

查閱說明書，電導(dǎo)率儀根據(jù)所測培養(yǎng)基電導(dǎo)率范圍為 0-20mS·cm-1，按說明書所述，配制 0.1mol·L-1和0.01mol·L-1的KCl溶液進(jìn)行標(biāo)定。標(biāo)定后的電導(dǎo)率儀測相應(yīng)校準(zhǔn)液，檢驗(yàn)結(jié)果是否與標(biāo)準(zhǔn)值一致。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用用EXCEL2003對數(shù)據(jù)進(jìn)行前期處理，SPSS17.0、Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。多重比較采用Duncan氏新復(fù)極差法，顯著性水平為P＜0.05，數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 GO對NaCl脅迫下樹莓組培苗生根培養(yǎng)效果的影響

由圖1可見，與對照相比,在含75mmol·L-1NaCl的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)35d,樹莓組培苗的株高顯著減小,減幅達(dá) 35.42%（P＜0.01），對根系的形成和生長的抑制作用明顯，總根長減幅達(dá)29.24%（P＜0.01），根尖數(shù)、根系表面積、根系體積減幅分別達(dá)40.55%（P＜0.01）、26.67%（P＜0.01）、21.06%，4 項(xiàng)指標(biāo)均有顯著差異，而根系平均直徑加粗11.75%。

Nacl脅迫下加0.05mg·L-1GO處理與單純Nacl脅迫處理相比，株高與根系總根長并未有明顯改變，而根系直徑略微變細(xì)。根數(shù)增加28.33%，根系表面積和根系體積分別減少20.35%、40.88%。Nacl脅迫下加2mg·L-1GO處理與單純Nacl脅迫處理相比,株高并沒有顯著變化，但生根情況明顯好轉(zhuǎn)。植株總根長、根數(shù)、根系表面積、根系體積均有顯著差異，分別增加 84.5%（P＜0.01）、119.89%（P＜0.01）、125.25%（P＜0.01）、152.63%（P＜0.01）。

由圖2可見，與對照相比,在含75mmol·L-1NaCl的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)35d,樹莓組培苗的形態(tài)發(fā)生明顯變化，植株葉量減少，株高降低，根系發(fā)育差。Nacl脅迫下加入2mg·L-1GO處理，植株葉量增加，生根效果好轉(zhuǎn)。

這些結(jié)果表明，添加適當(dāng)濃度的GO可減輕鹽脅迫對植株的傷害，促進(jìn)植株在鹽脅迫環(huán)境下根系的發(fā)育和植株生長。

圖1 GO對NaCl脅迫下樹莓組培苗生根培養(yǎng)效果的影響Figure1 Effect of GO on Rooting Culture of tissue culture seedlings of Rubus corchorifolius under NaCl Stress/mg·L-1圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差;同一組數(shù)據(jù)后小寫字母不同者，表示差異達(dá)顯著水平（P<0.05）

圖2 GO對NaCl脅迫下樹莓組培苗形態(tài)的影響Figure2 Effects of GO on morphology of tissue culture seedlings of Rubus corchorifolius under NaCl Stress/mg·L-1

2.2 GO對NaCl脅迫下樹莓組培苗抗氧化酶活性的影響

鹽堿環(huán)境脅迫下，植物體由于細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生增多，引發(fā)了活性氧的代謝紊亂，對細(xì)胞造成一系列的毒害[5]。ROS包括氧離子、過氧化物和含氧自由基等,存在未配對的自由電子，十分活躍。SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，能夠把02-·歧化生成H2O和O2。POD和CAT的反應(yīng)底物都是H2O2，能夠清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的H2O2，在抑制植物膜脂過氧化方面發(fā)揮著重要作用。SOD，POD，CAT是植物保護(hù)酶系統(tǒng)的成員，在鹽逆境中各自活性變化不完全相同。

圖3 GO對NaCl脅迫下樹莓組培苗根系中SOD、POD、CAT活性及蛋白含量的影響Figure3 Effects of GO on the activity of three protective enzymes SOD、POD、CATand protein contents in root of tissue culture seedlings of Rubus corchorifolius plantlets under NaCl stress/mg·L-1

圖4 GO對NaCl脅迫下樹莓組培苗莖中保護(hù)酶活性及蛋白含量的影響Figure4 Effects of GO on the activity of three protective enzymes and protein contents in steam of of tissue culture seedlings of Rubus corchorifolius plantlets under NaCl stress/mg·L-1

由圖3可見，在本實(shí)驗(yàn)中與對照相比,含75mmol·L-1NaCl的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)35d,根系中SOD和CAT兩種抗氧化酶活性均顯著下降，分別為44.16%和27.31%（P＜0.01），僅根系中POD活性顯著提高13.02%（P＜0.05）。Nacl脅迫下加入不同濃度GO處理與單獨(dú)Nacl脅迫處理相比，根系中三種抗氧化酶活性均顯著降低，兩種濃度僅僅在CAT活性方面表現(xiàn)略有不同。而根系中總蛋白含量顯著升高，兩種濃度無差異。

由圖4可見，在本實(shí)驗(yàn)中，與對照相比,在含75mmol·L-1NaCl的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)35d,莖段中POD、SOD抗氧化酶活性顯著下降，分別達(dá)21.61%和37.79%（P＜0.01）。莖段中蛋白含量顯著上升達(dá)54.14%（P＜0.01）。Nacl脅迫下加入不同濃度GO處理與單獨(dú)Nacl脅迫處理相比，莖段中POD與SOD活性顯著升高，其中加入2mg·L-1GO處理與單純Nacl脅迫處理相比POD與SOD抗氧化酶活性分別提高94.704%與70.304%（P＜0.01）。各處理莖段中未測到CAT保護(hù)酶。

總之，在鹽脅迫下樹莓根系生長受到抑制，根系通過提高POD酶活性來清除H2O2，而植株莖段中POD、SOD抗氧化酶活性顯著降低。兩種GO的添加使根系和莖段中3種抗氧化酶活性出現(xiàn)顯著變化。

2.3 NaCl脅迫各處理培養(yǎng)基電導(dǎo)率的變化

圖5 GO對NaCL脅迫下樹莓生根培養(yǎng)基電導(dǎo)率的影響Figure5 Effect of GO on electrical conductivity of Rubus corchorifolius rooting medium under NaCL stress

如圖5所示，在含75 mmol·L-1NaCl的生根培養(yǎng)基電導(dǎo)率為9.87mS·cm-1,顯著高于對照3.07 mS·cm-1。而添加 0.05mg·L-1與 2mg·L-1GO 后，電導(dǎo)率分別為 10.28mS·cm-1與 10.14mS·cm-1，均高于單獨(dú)NaCl脅迫處理的培養(yǎng)基電導(dǎo)率，兩種濃度GO均使培養(yǎng)基電導(dǎo)率顯著升高。本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基電導(dǎo)率發(fā)生變化，GO表面具有負(fù)電荷使培養(yǎng)基電導(dǎo)率升高。

3 結(jié)論與討論

Nacl脅迫對植物個體形態(tài)發(fā)育具有顯著的影響,整體表現(xiàn)為抑制植物組織和器官的生長。此次研究表明，適當(dāng)濃度的GO添加可減輕鹽脅迫對植株的傷害，促進(jìn)植株在鹽脅迫環(huán)境下根系的形成和植株生長。

氧化石墨烯可以吸附溶解性有機(jī)質(zhì)（DOM），同時,氧化石墨烯對重金屬離子、有機(jī)物等水體污染物也具備高吸附能力[5]。自然水環(huán)境中的DOM,包括腐殖酸、氨基酸、蛋白質(zhì)等,與氧化石墨烯通過π-π作用力、氫鍵和Lewis酸堿作用力等機(jī)制發(fā)生吸附行為[6]。此次研究中氧化石墨烯的兩種濃度都處于較低水平，兩種濃度氧化石墨烯對高濃度的Na離子吸附作用并不強(qiáng)烈。

植株在鹽脅迫條件下,體內(nèi)保護(hù)性酶(SOD、POD、CAT)能相互協(xié)調(diào)以降低植物體內(nèi)氧自由基水平,以維持植物體正常生長、代謝。此次研究表明單獨(dú)Nacl處理植株根系中三種保護(hù)酶活性僅POD較對照明顯升高，其余兩種酶活性均較對照下降。植株莖段中SOD、POD兩種酶活性顯著降低。在鹽脅迫下樹莓根系生長受到抑制，根系通過提高POD酶活性來清除H2O2。Nacl處理后添加GO植株根系三種保護(hù)酶活性顯著降低，而莖段中SOD、POD酶活性顯著升高。筆者認(rèn)為氧化石墨烯作為納米材料能夠滲透進(jìn)入植物根系細(xì)胞（研究結(jié)果待發(fā)表），并對有機(jī)物具有極強(qiáng)的吸附作用。氧化石墨烯能夠吸附抗氧化酶，并且其具有的巨大表面積能夠?yàn)槠涮峁┓磻?yīng)位點(diǎn)，提高反應(yīng)效率。

綜上所述，氧化石墨烯的添加能夠緩解鹽離子對植物的傷害，同時能夠通過吸附作用提升抗氧化酶反應(yīng)效率，提升植株抗氧化能力。