油用牡丹根結線蟲拮抗菌株的篩選和鑒定

李克勤，朱文成，曲永蘊，劉 慇，趙海軍，李廣強，季延平*

﹙1.萊州市文峰路街道農業綜合服務站，山東 萊州261431；2.山東省林業科學研究院森林保護研究所，山東 濟南 250014；3.菏澤市牡丹區牡丹研究所，山東 菏澤 274000；4.棗莊市三農服務中心，山東 棗莊 277000﹚

根結線蟲（Meloidogyne）世界性分布，可以侵染果樹、蔬菜、糧食作物、經濟作物以及觀賞植物等3000多種植物，造成嚴重的經濟損失，是一類重要的植物病原[1]。油用牡丹是我國獨有植物，原生物種，品種主要為“鳳丹”和“紫斑”，出油率30%以上，其中α-亞麻酸含量達42.34%[2]。但是，隨著油用牡丹栽培面積的迅速擴展，油用牡丹病害的發生危害呈上升的趨勢[3]。由于根結線蟲的危害，油用牡丹籽產量和品質已經受到嚴重影響，對當地經濟造成沉重打擊。針對油用牡丹根結線蟲病的防治，主要以高毒、高殘留的化學殺線蟲劑為主，長期使用污染土壤和水體，破壞生態環境，嚴重威脅人類健康。研究發現，近年來，國內外研究人員一直關注尋找殺線活性穩定并能夠大規模生產開發的微生物來防治根結線蟲[4-6]。研究發現，捕食線蟲真菌[7,8]、內寄生線蟲真菌[9]、機會真菌[10,11]、產毒真菌[12]等食線蟲真菌，寄生細菌[13,14]以及放線菌[9]等微生物具有殺線活性，可以用于線蟲生物防治，控制其危害。

本文在油用牡丹根結線蟲高效拮抗微生物篩選中，分離獲得1株高效殺線細菌HZ087，測定了其發酵液對油用牡丹根結線蟲二齡幼蟲、卵的殺滅效果，驗證其生防潛力，并采用形態學特征、生理生化特性以及16SrDNA序列分析，對HZ087菌株進行鑒定，以期為油用牡丹根結線蟲病的生物防治提供新的生防資源。

1 材料和方法

1.1 菌株分離

在山東省林科院試驗苗圃、壽光蔬菜大棚、菏澤市牡丹田，采集根際土壤樣品。采用稀釋分離法，稱取5g樣品，將樣品放入有50mL無菌水和有玻璃球的三角瓶中振蕩15min，將上清液依次稀釋，10-2-10-7，取100μL 10-5-10-7上清液均勻涂布于NA培養基上，25℃培養，72h后將單菌落接種到NA培養基上，4℃保存、備用。

1.2 供試根結線蟲的繁殖與準備

從感病的油用牡丹根部收集根結線蟲新鮮卵塊，1%NaClO溶液表面消毒，無菌水沖洗3次，置于25℃恒溫箱中。待孵化后收集幼蟲，配制根結線蟲液（100條/mL），4℃保存、備用。

1.3 殺線活性菌株的篩選

將分離獲得的細菌 25℃、200rpm振蕩培養48h，分別吸取1mL發酵液和0.5 mL線蟲液加入到滅菌的培養皿中，混合均勻，置25℃下培養48h，以不接菌的液體培養基為空白對照。每個處理重復3次。在培養皿中加入2滴0.05%亞甲基藍溶液，10min鏡檢，蟲體藍色表示死亡，活蟲不著色的表示正常[15]。分別統計死亡線蟲數和總蟲數，計算線蟲死亡率。

1.4 HZ087菌株發酵液對油用牡丹根結線蟲2齡幼蟲的毒殺效果測定

將HZ087菌株發酵液稀釋成5倍、10倍等2個梯度，測定方法同1.3。

1.5 HZ087菌株發酵液對油用牡丹根結線蟲卵的毒殺效果測定

將被根結線蟲侵染的油用牡丹根剪碎后置于三角瓶中，加入100mL 0.5%的NaClO溶液，振蕩2min，快速倒入200-500目篩組中，自來水沖洗10min，收集500目篩網中的卵，稀釋成3000粒／mL的卵懸浮液。毒殺效果測定采用室內離體培養法。在培養皿中加入2mL根結線蟲卵懸浮液，再加入相應的HZ087發酵液，配置成2倍、5倍、10倍等3個梯度，清水作對照，重復 3次，分別在 4d、6d、8d和10d觀察卵的孵化情況。

1.6 菌株鑒定

1.6.1 形態學鑒定

將菌株進行菌體形態染色，觀察培養性狀、生理生化指標測定。

1.6.2 分子生物學鑒定

采用細菌DNA提取試劑盒提取菌株DNA。菌株16S rRNA基因片段PCR擴增及序列測定。引物： 所用引物細菌通用引物 B27F （5′-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3′）；1492R （5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），由上海派森諾生物科技有限公司合成。

PCR反應體系：50 μL反應體系，包括：2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10 ×Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 5 μL，模板 DNA 1 μL，10 μmol/L 引物各 1 μL，5 U/μL Taq 酶 0.5 μL，雙蒸水 32.5 μL。PCR 擴增條件：94 °C 預變性 5 min；94 °C 變性 0.5min，52 °C 退火 0.5min，72 °C 1 min，30 個循環；72 °C 10 min[16]。

將獲得序列在 NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中進行比對，選取12株Bacillus sp.菌株，以Streptomyce albofaciens JCM 4342作為外圍菌株。利用MGEA 7.0中的Clustal W對各基因序列進行比對，然后利用MEGA 7.0軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建系統發育樹，以自展法（Bootstrap）進行檢測，共循環1000次。

1.7 數據處理與分析

數據處理采用SPSS 20.0軟件，差異顯著性分析采用Duncan氏多重比較法。

2 結果與分析

2.1 殺線菌株篩選

由表1可知，室內測定的561株菌株中，有217株菌株在一定程度上表現出殺傷油用牡丹根結線蟲二齡幼蟲的能力。用濃度為109cfu/mL的菌懸液處理幼蟲48h，校正死亡率在90%以上有1株菌株，占0.46%；校正死亡率在80%-90%有6株菌株，占1.97%；校正死亡率在70%-80%的有26株菌株，占11.98%。

表1 處理48h油用牡丹根結線蟲二齡幼蟲室內校正死亡率在70%以上的菌株

2.2 HZ087發酵液對油用牡丹根結線蟲二齡幼蟲的抑制作用

從表2可以看出，處理 12h、24h、36h和 48h后，隨著處理時間的增加，HZ087發酵液對2齡幼蟲的抑制作用越來越強，而清水對照組的抑制率基本不變。處理相同時間內，不同發酵液濃度對油用牡丹根結線蟲二齡幼蟲的抑制作用不同，稀釋5倍液的抑制效果顯著高于稀釋10倍液和清水對照。在處理后48h，發酵液稀釋5倍液的校正死亡率達到90.83%。

表2 HZ087對油用牡丹根結線蟲二齡幼蟲活力的抑制作用

2.3 HZ087發酵液對油用牡丹根結線蟲卵孵化率的影響

從表3可以看出，HZ087發酵液不同稀釋倍數處理后，油用牡丹根結線蟲卵的孵化率不同。稀釋倍數越高，卵的孵化率越高，稀釋倍數與卵的孵化率成正比。同一稀釋倍數，隨著處理時間的增加，卵的孵化率增加。HZ087菌懸液2倍稀釋液處理后的第4d，根結線蟲卵的孵化率最低，7.27%，抑制效果隨著稀釋倍數增高成遞減。HZ087發酵液稀釋10倍處理第10d，根結線蟲卵的孵化率為64.77%，僅低于清水處理。

表3 HZ087發酵液處理后油用牡丹根結線蟲卵的孵化率

2.4 菌株鑒定

2.4.1 HZ087菌株形態特征

HZ087菌株革蘭氏染色陽性，周生鞭毛，桿狀、長為6.2～12.1μm，寬0.9～1.5μm。在NA培養基上25℃培養48h后，菌落平展、乳白色、圓形，表面不規則，中間有圓環形突起，邊緣不整齊，不產色素。在NB液體培養，棕黃色，渾濁，有沉淀，形成菌膜。

2.4.2 HZ087菌株生理生化特性

NaCl濃度在2%～10%之間HZ087菌株生長性狀一致。氧化酶陽性，硝酸鹽還原試驗弱陽性，能利用檸檬酸鹽，能產生尿素酶分解尿素，不產H2S，VP試驗陽性，能利用苦杏仁苷、ZT，具體見表4。

表4 HZ087菌株的生理生化特性

2.4.3 HZ087菌株基于16S rDNA的系統發育分析

將HZ087菌株的16SrDNA擴增序列在NCBI數據庫中比對，與Bacillus amyloliquefaciens同源性為99%。采用鄰接法（Neighbor-Joining）構建的NJ系統發育樹。由圖1可知，NJ系統發育樹中，標尺指示0.02步變化，節點處為自展率，分支長度和為0.4422。HZ087菌株與B.amyloliquefaciens JC-07、B.amyloliquefaciens S2QPS31菌株聚在一個分支上，自展率為99%，表明HZ087菌株為B.amyloliq uefaciens，結合HZ087菌株的形態特征、生理生化特性，鑒定HZ087菌株為解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens。

圖1 利用鄰接法（NJ）基于HZ087菌株16SrDNA基因數據構建的系統發育樹。自展支持率標注于節點處，標尺指示0.02步變化。

3 結論與討論

根結線蟲的生防因子有真菌、細菌、病毒和原生動物等，由于細菌易培養、繁殖速度快，后期易加工等特點，生防細菌在根結線蟲生物防治研究中占有重要地位。目前研究比較多的有巴氏桿菌、假單胞菌、蘇云金桿菌、堅強芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等[13,14,17-20]。本研究從土壤中分離獲得1株對油用牡丹根結線蟲具有較強殺線活性的細菌菌株HZ087，根據形態特征、生理生化特性以及16SrDNA序列分析，鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌。1943年Fukumoto首次發現了解淀粉芽孢桿菌 （Bacillus amyloliquefaciens），1987年 Priest確立為一個單獨的種。解淀粉芽孢桿菌在自然界廣泛存在，可以用來防治植物真菌病害、細菌病害、線蟲、植物病毒等，具有開發成生物農藥的潛力，應用前景廣闊，是一類重要的優良的生防微生物資源。室內測定發現，HZ087發酵液不僅對油用牡丹根結線蟲2齡幼蟲具有較強的抑制作用，而且可以抑制卵的孵化。拮抗細菌可以產生殺毒物質直接殺死線蟲、通過占據營養和空間位點來抑制根結線蟲，也可以在“細菌-寄主-根結線蟲”系統中，通過分泌物質改變寄主根系分泌物，避免線蟲危害寄主植物。本研究獲得解淀粉芽孢桿菌HZ087菌株對油用牡丹根結線蟲的作用機理還需要進一步研究。

本試驗只是在離體條件下測定抑制效果，田間土壤中微生物種類繁多，土壤環境復雜，HZ087菌株能否有效定殖、防治效果還有待進一步研究。