黑楊派無性系花粉活力研究

周廣波 ，張傳玉 ，陳甘牛 ，沈?qū)W夫 ，馬春燕 ，董玉峰 ，李善文 *

（1.莘縣國有馬西林場，山東 莘縣 252400；2.費縣國有祊河林場，山東 費縣 273400；3.煙臺市林業(yè)科學(xué)研究所，山東 煙臺264000；4.沂南縣國有孟良崮林場，山東 沂南 276300；5.日照市林業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，山東 日照 276800；6.山東省林業(yè)科學(xué)研究院，山東省林木遺傳改良重點實驗室，山東 濟(jì)南 250014）

楊樹是山東省重要的速生用材林和生態(tài)防護(hù)林樹種，在工業(yè)用材林建設(shè)和鄉(xiāng)村綠化中占有重要地位，對生態(tài)文明建設(shè)和鄉(xiāng)村振興發(fā)揮著顯著作用[1-3]。目前，山東省推廣應(yīng)用的楊樹良種主要是通過雜交育種選育的，在雜交育種過程中，由于父母本的花期不遇或者在異地采集花枝，在室內(nèi)進(jìn)行切枝水培雜交時必須對花粉進(jìn)行提前收集和儲藏，經(jīng)過儲存后的花粉活力的高低，是楊樹雜交育種成敗的關(guān)鍵[4-6]。因此，研究楊樹無性系的花粉活力具有重要意義。

本研究以黑楊派的美洲黑楊和歐洲黑楊花粉為試驗材料，經(jīng)過低溫儲藏一段時間后，測定其花粉活力，研究無性系花粉萌發(fā)率的變異，選擇花粉活力較高的無性系，為楊樹雜交育種中父本選擇和花粉儲存提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為黑楊派（Aigeiros）的北方型美洲黑楊 （P.deltoides）、南方型美洲黑楊和歐洲黑楊（P.nigra），共包括22個無性系，見表1。

表1 試驗材料

1.2 試驗方法

1.2.1 花枝培養(yǎng)

將采集的楊樹花枝用塑料膜包裹，同種無性系包裹在同一個標(biāo)記名稱的塑料袋中，上口用繩子扎緊，防止花枝失水，置于4℃氣調(diào)庫中低溫儲藏。花枝在氣調(diào)庫中放置1周左右開始水培，將楊樹枝條上無花芽的枝條剪去，并將下端浸泡在水中剪成斜向切口。修剪好的花枝放于裝有干凈清水的水桶中，在能照射到陽光的試驗室中水培，每一桶的楊樹花枝都需要掛標(biāo)簽注明無性系名稱和水培時間。不同無性系的花枝放在不同實驗室中，防止花粉污染。水培過程中每2天換清水1次[7]。

1.2.2 花粉收集

1.2.3 花粉保存

在培養(yǎng)皿中將雜質(zhì)挑出后，用硫酸紙折成紙包，將花粉倒入硫酸紙紙包中，并標(biāo)記無性系名稱和采集時間。將硫酸紙紙包和變色硅膠一起放入密封袋中，密封袋上標(biāo)記無性系名稱，放入4℃冰箱中儲存50天。變色硅膠是為保持花粉干燥，保存期間硅膠粒吸收水分變色，發(fā)現(xiàn)變色時要及時更換硅膠。

1.2.4 花粉培養(yǎng)基的配制

A培養(yǎng)基的成分：1%的瓊脂，15%的蔗糖，10mg/L的硼酸。

B培養(yǎng)基的成分：1%的瓊脂，15%的蔗糖。

使用去離子水配制上述培養(yǎng)基，在水浴鍋中加熱至瓊脂融化[5-6,8]。

氯氮平購自Sigma(美國)，阿立哌唑購自中國食品藥品檢定研究院，喹硫平、齊拉西酮、氯氮平-d3、喹硫平-d8和齊拉西酮-d8購自Toronto research chemicals Inc(加拿大)，N-去甲基氯氮平、阿立哌唑-d8購自 cerilliant(美國)，色譜甲醇、乙腈購自默克公司(德國)，屈臣氏蒸餾水購自廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

1.2.5 花粉培養(yǎng)

首先用魯林16號和中菏1號的花粉分別在A培養(yǎng)基和B培養(yǎng)基上培養(yǎng)，選擇合適的培養(yǎng)基，再用較合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)全部無性系的花粉，測定萌發(fā)率?；ǚ鄯謩e在培養(yǎng) 22h、24h、26h、28h、30h 時測定其萌發(fā)率，確定萌發(fā)率最高的培養(yǎng)時間，后續(xù)其他無性系花粉的培養(yǎng)以此培育時間測定萌發(fā)率。

在花粉接種之前，先將低溫貯藏的花粉置于常溫條件下3～4h。在培養(yǎng)基冷卻凝固之前用滴管滴到凹玻片上，待其冷卻凝固后才可接種花粉，防止培養(yǎng)基溫度太高損傷花粉，影響測定結(jié)果。滴培養(yǎng)基時緩慢滴出，盡量減少氣泡的產(chǎn)生，以免干擾觀察。用毛筆沾取少量待測花粉，輕輕抖落在培養(yǎng)基上?；ǚ坶L時間貯藏后由于失水和受擠壓容易板結(jié)成塊，此時應(yīng)當(dāng)隔硫酸紙將花粉塊稍加揉捏呈粉末狀后再進(jìn)行接種。

取干凈的大號培養(yǎng)皿，在其中鋪墊上濕潤濾紙，以維持萌發(fā)環(huán)境的濕度。將玻片放在培養(yǎng)皿中，玻片上貼有注明名稱的標(biāo)簽，蓋上蓋子以防止水分過度蒸發(fā)或有污染物飄落到培養(yǎng)基上。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中，在光照下靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，應(yīng)當(dāng)及時觀察濾紙的濕潤情況，過于干燥時應(yīng)當(dāng)補充水分，保證良好的花粉萌發(fā)環(huán)境。

1.2.6 花粉萌發(fā)率的測定

在顯微鏡10×目鏡和10×物鏡下觀察花粉發(fā)育情況，選取一個視野，盡量保證視野中無花粉垛疊情況，計數(shù)一百粒花粉，并計數(shù)其中已萌發(fā)的花粉數(shù)量，計算其萌發(fā)率。重復(fù)三次，所選取的三個視野沒有重疊部分，取平均數(shù)。當(dāng)萌發(fā)出的花粉管長度大于花粉的長度時，可將其視為已萌發(fā)的花粉[12]。

花粉萌發(fā)率（%）=符合萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)的花粉數(shù)/100×100%

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選培養(yǎng)基

魯林 16 號花粉在培養(yǎng) 22h、24h、26h、28h、30h的萌發(fā)率見圖1，A培養(yǎng)基的萌發(fā)率皆高于B培養(yǎng)基。在A培養(yǎng)基中，魯林16號的萌發(fā)率呈現(xiàn)有規(guī)律的升高降低趨勢，而在B培養(yǎng)基中，數(shù)據(jù)起伏波動，除去選取視野的誤差可能外，也說明B培養(yǎng)基不適于魯林16號花粉的生長萌發(fā)，A培養(yǎng)基比較適合魯林16號，有硼酸的情況下魯林16號的花粉生長狀況較好。

圖1 魯林16號花粉在A、B培養(yǎng)基中的萌發(fā)率

中菏1號花粉的生長情況與魯林16號類似，見圖2。雖然在培養(yǎng)28h、30h后觀察得到的數(shù)據(jù)都是B培養(yǎng)基中較高，但是在培養(yǎng)26h時，A培養(yǎng)基中的萌發(fā)率超過了B培養(yǎng)基中的一倍多，并且A培養(yǎng)基中的數(shù)據(jù)變化也是比較有規(guī)律，而B培養(yǎng)基中的萌發(fā)率則波動起伏且最高與最低變化不大。因此，A培養(yǎng)基更適合中菏1號花粉的生長萌發(fā)，有硼酸的情況下中菏1號的花粉生長狀況較好。

圖2 中菏1號花粉在A、B培養(yǎng)基中的萌發(fā)率

由以上分析可知，魯林16號和中菏1號的花粉在A培養(yǎng)基上萌發(fā)率較高。

2.2 最適培養(yǎng)時間

魯林16號、中菏1號和中雄2號在分別培養(yǎng)22h、24h、26h、28h、30h 時的萌發(fā)率見圖3。由折線圖可以看出，雖然三個無性系的花粉萌發(fā)率具體變化不盡相同，但是大體趨勢是一樣的，隨著培養(yǎng)時間的加長，萌發(fā)率逐漸升高，培養(yǎng)到26h萌發(fā)率達(dá)到頂峰，而后期由于培育時間過長，花粉管逐漸破裂，導(dǎo)致萌發(fā)率降低。因此，3個無性系的花粉最高萌發(fā)率均出現(xiàn)在培養(yǎng)26h時，以下的萌發(fā)率都是在A培養(yǎng)基中培養(yǎng)26h的數(shù)據(jù)。

2.3 不同無性系花粉活力比較

2.3.1 北方型美洲黑楊無性系花粉活力比較

北方型美洲黑楊的5個無性系花粉在4℃冰箱儲存50天后，萌發(fā)率的變異范圍為9.3%-29.7%，平均萌發(fā)率是16.6%，最低的是無性系T137，最高的是T144，二者相差20.4%，見圖4。因此，北方型美洲黑楊無性系花粉在4℃冰箱儲存50天后，花粉仍然具有活力，無性系間的花粉活力存在較大差異。

2.3.2 南方型美洲黑楊無性系花粉活力比較

南方型美洲黑楊的8個無性系花粉在4℃冰箱儲存50天后，萌發(fā)率的變異范圍為8.0%-32.0%，平均萌發(fā)率是15.1%，最低的是無性系魯林3號，最高的是L23，二者相差32.0%，見圖4。因此，南方型美洲黑楊無性系花粉在4℃冰箱儲存50天后，花粉仍然具有活力，無性系間的花粉活力也存在較大變異。

由上述分析可知，北方型美洲黑楊和南方型美洲黑楊的花粉在4℃冰箱儲存50天后均有一定的活力，北方型美洲黑楊和南方型美洲黑楊花粉活力較高的分別是T144和L23。

圖4 美洲黑楊花粉萌發(fā)率

2.3.3 歐洲黑楊無性系花粉活力比較

歐洲黑楊9個無性系花粉在4℃冰箱儲存50天后，萌發(fā)率的變異范圍為0-11.3%，平均萌發(fā)率是5.3%，最低的是無性系歐黑7號，最高的是歐黑5號，二者相差11.3%，見圖5。因此，歐洲黑楊無性系花粉在4℃冰箱儲存50天后，多數(shù)無性系的花粉仍然具有活力，無性系間的花粉活力同樣存在較大變異。

圖5 歐洲黑楊花粉萌發(fā)率

由上述分析可知，歐洲黑楊的花粉平均萌發(fā)率低于美洲黑楊的平均萌發(fā)率，說明4℃環(huán)境下較長時間儲存對歐洲黑楊花粉損傷較大，花粉活力降低較快。北方型美洲黑楊的花粉平均萌發(fā)率略高于南方型的平均萌發(fā)率。另外，歐洲黑楊中的歐黑7號萌發(fā)率為0，即花粉受到損傷過大，沒有萌發(fā)出花粉管；而從雜交試驗結(jié)果看，歐黑7號的新鮮花粉和短期低溫儲存的花粉都具有可育性，表明這個無性系的花粉不適合較長時間的低溫儲藏。

3 結(jié)論

黑楊派無性系花粉生活力測定適宜的養(yǎng)基成分包括1%的瓊脂、15%的蔗糖和10mg/L的硼酸，花粉培養(yǎng)26h時萌發(fā)率最高。

黑楊派無性系的花粉在4℃冰箱儲存50天后，花粉萌發(fā)率存在較大變異，其變異范圍為0-32%，北方型美洲黑楊、南方型美洲黑楊和歐洲黑楊的花粉活力最高的無性系分別是T144、L23和歐黑5號，其花粉萌發(fā)率分別是29.7%、32.0%和11.3%。