白蛾周氏嚙小蜂繁育壞蛹病原菌傳播機制的研究

馬春艷，閆豐軍*，鄭召坤，安 靜，王婷婷

（1.日照市自然資源和規(guī)劃局，山東 日照276800；2.日照市嵐山區(qū)巨峰鎮(zhèn)農技站，山東 日照 276800）

白蛾周氏嚙小蜂是美國白蛾等鱗翅目食葉害蟲的重要寄生性天敵。利用柞蠶蛹繁育釋放周氏嚙小蜂已是一項成熟的技術，但繁育過程中柞蠶蛹的爛蛹問題十分嚴重，嚴重影響繁育效率，增加繁育成本。用于繁育的柞蠶蛹是按照原國家林業(yè)局制定的質量檢驗標準[1]嚴格挑選的，但總體爛蛹率仍時常高達30%，有時高達50%以上，甚至在個別繁育箱中柞蠶蛹全部爛掉。程瑞春等[2]認為柞蠶靈菌敗血病是壞蛹的主要病原菌。程瑞春等[3]利用抗生素對3個病原菌菌株進行了抑菌試驗，結果顯示即使采用最好的抗生素注射預防，仍有大約30%蠶蛹因發(fā)生細菌病害而使小蜂敗育。其他解決柞蠶蛹壞蛹的方法主要是對繁蜂環(huán)境和柞蠶蛹都進行消毒。典型試驗研究如張寧等[4]采用酒精、新潔爾滅以及消毒柜等不同方法對柞蠶蛹進行了消毒研究。童玲等[5]對腐爛蠶繭中的細菌進行了鑒定研究，同時認為柞蠶繭蛹的消毒與否與柞蠶蛹腐爛率無關。要減少壞蛹應首先應探索導致壞蛹的病原菌在繁育過程中的傳播機制，然后有針對性地采取措施，從而降低病原菌的傳播幾率。本文通過進行大量試驗，對小蜂繁育過程中壞蛹病原菌傳播機制進行了深入研究。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

柞蠶蛹由煙臺志芳養(yǎng)殖公司從遼寧省購進。白蛾周氏嚙小蜂種蛹由煙臺市森保站提供。

繁育箱為木盒0.5m*0.6 m*0.3 m的木盒，底盒和蓋均為厚0.01 m的泡桐板。

試驗用針頭是醫(yī)用最細的注射用針頭。

小蜂浸泡離心液，是將出蜂1 d后的5個種蛹及小蜂浸泡1 h后，用離心機離心30 min，取底層濃縮但無雜質部分作為試驗用注射液。

1.2 試驗方法

為研究周氏嚙小蜂繁育過程中柞蠶蛹壞蛹病原菌的傳播機制，本研究設計了9個處理。試驗前，將柞蠶蛹按照健康蛹的感官標準分揀好，再混勻，然后均勻放置在繁育箱中，并于同一時間接蜂；接蜂后隔2 d即第4 d開箱，挑揀出壞蛹，此后每隔一天進行一次壞蛹挑揀，直到10 d后結束分揀，檢查統(tǒng)計各個繁育箱的柞蠶蛹總量和壞蛹數量，計算壞蛹率。所有試驗均在同一繁蜂室內進行，繁蜂溫度控制在25℃、濕度保持在60%。

1.2.1 殺菌燈照射后不接蜂然后封箱

接蜂前先用40 w殺菌燈照射30 min，照射距離大于1 m，不接蜂，然后再封箱。本處理的研究目的是驗證壞蛹病原菌是否通過空氣傳播。

1.2.2 不用殺菌燈照射不接蜂然后封箱

不用殺菌燈照射，將繁育箱直接蜂箱。本處理作為處理1的對照。

1.2.3 封閉木箱接蜂

接蜂后將繁蜂箱的木蓋迅速蓋上并用膠帶纏繞封閉好，防止小蜂逃逸。本處理方法是當前各地通用的接蜂方法。

1.2.4 用無菌醫(yī)用針頭扎

用醫(yī)用針頭扎后，封箱。本處理設計目的是查驗壞蛹是否是因柞蠶蛹體不帶毒的健康小蜂產卵器刺傷引發(fā)。

1.2.5 用蘸過壞蛹液針頭扎

壞蛹含有大量導致壞蛹的病原菌。用蘸有壞蛹體液的針頭扎柞蠶蛹的體壁，是模擬周氏嚙小蜂雌蜂產卵的過程，如出現壞蛹率高于用干凈針頭扎的情況，則可進一步驗證壞蛹是由帶病周氏嚙小蜂產卵導致。

1.2.6 注射小蜂浸泡離心液

本試驗是檢驗白蛾周氏嚙小蜂成蜂是否攜帶壞蛹病菌，如壞蛹率顯著高于注射蒸餾水的柞蠶蛹，則可確認小蜂成蜂攜帶壞蛹病原菌。

1.2.7 注射蒸餾水

注射蒸餾水的處理作為注射小蜂浸泡離心液的對照。

1.2.8 柞蠶蛹蘸壞蛹液

柞蠶蛹蘸取壞蛹體液封箱后，觀察統(tǒng)計壞蛹率，如壞蛹率很低則說明壞蛹病原菌并不能通過體表接觸傳播。

1.2.9 用與壞蛹相處1 h的小蜂接蜂

用壞蛹相處1 h的小蜂接蜂，如壞蛹率明顯高于殺菌燈照射后不接蜂封箱和不用殺菌燈照射不接蜂封箱，則可進一步確認壞蛹病菌是通過小蜂產卵傳播。

1.3 數據分析

試驗數據用Excel整理，利用SPSS 21進行試驗數據的統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 壞蛹病原傳播機制試驗結果

2.1.1 各試驗壞蛹率均值（見表1）

表1 各試驗處理壞蛹率均值Table1 Mena value of bad pupa percent of treatments

2.1.2 壞蛹率均值多重比較

通過SPSS 21分析，不同試驗間差異非常顯著，但方差非齊性（見表2、表3），故采用單因素方差分析中沒有齊性要求的 Tamhane、Dunnett T3、Games-Howell和Dunnett C比較法對各試驗均值進行多重比較（見表4）。

表2 壞蛹率單因素方差分析組間差異顯著性Table2 The differences of groups of bad pupa percent with single factor analysis of variances

表3 壞蛹率方差齊性檢驗Table3 Homogeneity test of variances of bad pupa percent

2.2 試驗結果分析

2.2.1 鑒于“殺菌燈照射后不接蜂封箱”、“不用殺菌燈照射不接蜂封箱”，二者壞蛹率無顯著差異，表明壞蛹病原菌不能隨空氣傳播。二者壞蛹率顯著小于“封閉木箱接蜂”、“用蘸過壞蛹液針頭扎”的，而顯著大于“用干凈針頭扎”表明，壞蛹病原菌可通過帶毒物體刺穿健康柞蠶蛹傳播，而小蜂產卵是重要的傳播途徑。

表4 試驗數據的多重比較Table4 Multiple comparisons of experimental data

比較方法(I)處理方式 (J)處理方式 均值差(I-J) 標準誤 顯著性注射小蜂浸泡離心液注射蒸餾水殺菌燈照射后不接蜂封箱不用殺菌燈照射不接蜂封箱封閉木箱接蜂用干凈針頭扎用蘸過壞蛹液針頭扎注射蒸餾水柞蠶蛹蘸壞蛹液用壞蛹相處1 h的小蜂接蜂殺菌燈照射后不接蜂封箱不用殺菌燈照射不接蜂封箱封閉木箱接蜂用干凈針頭扎用蘸過壞蛹液針頭扎注射小蜂浸泡離心液柞蠶蛹蘸壞蛹液用壞蛹相處1 h的小蜂接蜂0.2003625*0.1889375-0.1349625 0.1511000-0.7774625*0.0607750 0.1524750-0.0799250 0.1395875*0.1281625*-0.1957375 0.0903250-0.8382375*-0.0607750 0.0917000*-0.1407000 0.0418043 0.0417994 0.0813111 0.0503185 0.0417431 0.0437953 0.0426028 0.0656401 0.0134404 0.0134254 0.0710250 0.0310645 0.0132491 0.0437953 0.0157496 0.0523610 0.068 0.093 0.984 0.323 0.000 1.000 0.248 1.000 0.000 0.001 0.354 0.434 0.000 1.000 0.003 0.637 Tamhane柞蠶蛹蘸壞蛹液殺菌燈照射后不接蜂封箱不用殺菌燈照射不接蜂封箱封閉木箱接蜂用干凈針頭扎用蘸過壞蛹液針頭扎注射小蜂浸泡離心液注射蒸餾水用壞蛹相處1 h的小蜂接蜂0.0478875*0.0364625-0.2874375*-0.0013750-0.9299375*-0.1524750-0.0917000*-0.2324000 0.0088102 0.0087872 0.0702960 0.0293594 0.0085154 0.0426028 0.0157496 0.0513678 0.022 0.112 0.021 1.000 0.000 0.248 0.003 0.082用壞蛹相處1 h的小蜂接蜂殺菌燈照射后不接蜂封箱不用殺菌燈照射不接蜂封箱封閉木箱接蜂用干凈針頭扎用蘸過壞蛹液針頭扎注射小蜂浸泡離心液注射蒸餾水柞蠶蛹蘸壞蛹液0.2802875*0.2688625*-0.0550375 0.2310250-0.6975375*0.0799250 0.1407000 0.2324000 0.0507074 0.0507035 0.0862273 0.0579276 0.0506571 0.0656401 0.0523610 0.0513678 0.031 0.039 1.000 0.075 0.000 1.000 0.637 0.082殺菌燈照射后不接蜂封箱不用殺菌燈照射不接蜂封箱封閉木箱接蜂用干凈針頭扎用蘸過壞蛹液針頭扎注射小蜂浸泡離心液注射蒸餾水柞蠶蛹蘸壞蛹液用壞蛹相處1 h的小蜂接蜂-0.0114250*-0.3353250*-0.0492625-0.9778250*-0.2003625*-0.1395875*-0.0478875*-0.2802875*0.0031319 0.0698149 0.0281881 0.0022597 0.0418043 0.0134404 0.0088102 0.0507074 0.046 0.004 0.869 0.000 0.039 0.000 0.014 0.018 Dunnett T3不用殺菌燈照射不接蜂封箱殺菌燈照射后不接蜂封箱封閉木箱接蜂用干凈針頭扎用蘸過壞蛹液針頭扎注射小蜂浸泡離心液注射蒸餾水柞蠶蛹蘸壞蛹液用壞蛹相處1 h的小蜂接蜂0.0114250*-0.3239000*-0.0378375-0.9664000*-0.1889375-0.1281625*-0.0364625-0.2688625*0.0031319 0.0698120 0.0281810 0.0021685 0.0417994 0.0134254 0.0087872 0.0507035 0.046 0.006 0.980 0.000 0.052 0.000 0.067 0.023

比較方法(I)處理方式 (J)處理方式 均值差(I-J) 標準誤 顯著性封閉木箱接蜂用干凈針頭扎用蘸過壞蛹液針頭扎殺菌燈照射后不接蜂封箱不用殺菌燈照射不接蜂封箱用干凈針頭扎用蘸過壞蛹液針頭扎注射小蜂浸泡離心液注射蒸餾水柞蠶蛹蘸壞蛹液用壞蛹相處1 h的小蜂接蜂殺菌燈照射后不接蜂封箱不用殺菌燈照射不接蜂封箱封閉木箱接蜂用蘸過壞蛹液針頭扎注射小蜂浸泡離心液注射蒸餾水柞蠶蛹蘸壞蛹液用壞蛹相處1 h的小蜂接蜂殺菌燈照射后不接蜂封箱不用殺菌燈照射不接蜂封箱封閉木箱接蜂用干凈針頭扎注射小蜂浸泡離心液注射蒸餾水柞蠶蛹蘸壞蛹液用壞蛹相處1 h的小蜂接蜂0.3353250*0.3239000*0.2860625*-0.6425000*0.1349625 0.1957375 0.2874375*0.0550375 0.0492625 0.0378375-0.2860625*-0.9285625*-0.1511000-0.0903250 0.0013750-0.2310250 0.9778250*0.9664000*0.6425000*0.9285625*0.7774625*0.8382375*0.9299375*0.6975375*0.0698149 0.0698120 0.0752229 0.0697783 0.0813111 0.0710250 0.0702960 0.0862273 0.0281881 0.0281810 0.0752229 0.0280974 0.0503185 0.0310645 0.0293594 0.0579276 0.0022597 0.0021685 0.0697783 0.0280974 0.0417431 0.0132491 0.0085154 0.0506571 0.004 0.006 0.028 0.000 0.948 0.285 0.019 1.000 0.869 0.980 0.028 0.000 0.227 0.283 1.000 0.053 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 Dunnett T3注射小蜂浸泡離心液殺菌燈照射后不接蜂封箱不用殺菌燈照射不接蜂封箱封閉木箱接蜂用干凈針頭扎用蘸過壞蛹液針頭扎注射蒸餾水柞蠶蛹蘸壞蛹液用壞蛹相處1 h的小蜂接蜂0.2003625*0.1889375-0.1349625 0.1511000-0.7774625*0.0607750 0.1524750-0.0799250 0.0418043 0.0417994 0.0813111 0.0503185 0.0417431 0.0437953 0.0426028 0.0656401 0.039 0.052 0.948 0.227 0.000 0.977 0.142 0.997注射蒸餾水柞蠶蛹蘸壞蛹液殺菌燈照射后不接蜂封箱不用殺菌燈照射不接蜂封箱封閉木箱接蜂用干凈針頭扎用蘸過壞蛹液針頭扎注射小蜂浸泡離心液柞蠶蛹蘸壞蛹液用壞蛹相處1 h的小蜂接蜂殺菌燈照射后不接蜂封箱不用殺菌燈照射不接蜂封箱封閉木箱接蜂用干凈針頭扎用蘸過壞蛹液針頭扎注射小蜂浸泡離心液注射蒸餾水用壞蛹相處1 h的小蜂接蜂0.1395875*0.1281625*-0.1957375 0.0903250-0.8382375*-0.0607750 0.0917000*-0.1407000 0.0478875*0.0364625-0.2874375*-0.0013750-0.9299375*-0.1524750-0.0917000*-0.2324000*0.0134404 0.0134254 0.0710250 0.0310645 0.0132491 0.0437953 0.0157496 0.0523610 0.0088102 0.0087872 0.0702960 0.0293594 0.0085154 0.0426028 0.0157496 0.0513678 0.000 0.000 0.285 0.283 0.000 0.977 0.003 0.397 0.014 0.067 0.019 1.000 0.000 0.142 0.003 0.048

注*.均值差的顯著性水平為0.05。

2.2.2 “用干凈針頭扎”與“用蘸過壞蛹液針頭扎”壞蛹率有明顯差異，表明非帶毒物體刺穿并不能導致壞蛹顯著增多；而帶毒物體刺穿柞蠶蛹體可傳播壞蛹病原菌。

2.2.3 “注射小蜂浸泡離心液”壞蛹率與“用蘸過壞蛹液針頭扎”有顯著差異，而與“殺菌燈照射后不接蜂封箱”、“不用殺菌燈照射不接蜂封箱”均無顯著差異，表明通過浸泡小蜂及掰開的種蛹并離心得到的液體，可能壞蛹病原菌濃度不夠，或根本不帶病原菌，無法通過本試驗斷定小蜂成蜂及寄生過的種蛹是否帶有壞蛹病原菌。如要得到確定結論，應當對離心后的浸泡液進行分離再培養(yǎng)研究。

2.2.4 “用壞蛹相處1 h的小蜂接蜂”壞蛹率顯著高于“殺菌燈照射后不接蜂封箱”、“不用殺菌燈照射不接蜂封箱”，而與“封閉木箱接蜂”、“注射小蜂浸泡離心液”無顯著差異，表明小蜂高強度接觸而使小蜂產卵器帶毒從而增加了壞蛹率，相當于正常木箱接蜂的水平。

3 結論與討論

3.1 雖然經過人工分揀，但仍有2%-3%柞蠶蛹攜帶壞蛹病菌。由于小蜂產卵前有用產卵器探查的習性，雌成蜂在刺穿病蛹表皮、未產卵但攜帶壞蛹病菌，在健康柞蠶蛹上產卵過程中將壞蛹病菌傳播到健康蠶蛹，從而導致壞蛹數量增加。因此，小蜂產卵是周氏嚙小蜂繁育過程中導致壞蛹的主要途徑，小蜂種蜂產卵接蜂的過程，也是壞蛹病菌的傳播過程。白蛾周氏嚙小蜂成為壞蛹病原菌傳播的媒介。壞蛹病原菌不能通過空氣傳播，也不能通過接觸傳播。

3.2 降低壞蛹率的關鍵措施是注意在繁育接蜂過程中對白蛾周氏嚙小蜂雌成蜂及其產卵器進行消毒。