甘草酸對大鼠體內硝苯地平藥動學的影響

毛俊 朱項羽 夏宏光 王志豪 劉慧茹 江海燕 金涌

中圖分類號 R965 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）21-2942-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.21.13

摘 要 目的：研究甘草酸對大鼠體內硝苯地平藥動學的影響。方法：將大鼠隨機分為實驗組和對照組，每組10只。實驗組大鼠灌胃甘草酸5 mg/kg，對照組灌胃等量的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，每日1次，連續給藥14 d，第14天灌胃30 min后，2組大鼠均灌胃硝苯地平3 mg/kg，并于灌胃硝苯地平前與灌胃后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h眼內眥靜脈叢采血0.5 mL。采用高效液相色譜法，以地西泮為內標，測定其中硝苯地平的濃度;色譜柱為ODS-C18;流動相為甲醇-水（62 ∶ 38，V/V，乙酸調pH為4.5）;流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測波長為238 nm;進樣量為20 μL。使用Winonlin 6.0軟件計算藥動學參數，t檢驗進行統計分析。結果：實驗組和對照組大鼠體內硝苯地平的主要藥動學參數tmax分別為（1.40±0.15）、（1.50±0.01） h;cmax分別為（0.15±0.03）、（0.29±0.09） mg/L;t1/2分別為（4.70±1.17）、（5.20±1.38） h;AUC0-24 h分別為（1.00±0.10）、（1.89±0.37） mg·h/L;AUC0-∞分別為（1.00±0.16）、（1.98±0.32） mg·h/L;MRT分別為（6.76±0.64）、（6.60±1.36） h。與對照組比較，實驗組大鼠體內硝苯地平的cmax、AUC0-24 h、AUC0-∞均明顯降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。結論：甘草酸可能會降低硝苯地平在大鼠體內的生物利用度，兩藥聯用時建議增加硝苯地平的劑量以達到有效的血藥濃度。

關鍵詞 甘草酸;硝苯地平;地西泮;高效液相色譜法;藥動學;大鼠

Effects of Glycyrrhizic Acid on Pharmacokinetics of Nifedipine in Rats

MAO Jun1，2，ZHU Xiangyu1，XIA Hongguang1，WANG Zhihao1，LIU Huiru2，JIANG Haiyan1，JIN Yong1（1.Key Lab of Anti-inflammatory and Immune Medicine， Ministry of Education， School of Pharmacy， Anhui Medical University， Hefei 230032， China;2.Dept. of Pharmacy， Hefei Second People’s Hospital， Hefei 230026， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the effects of glycyrrhizic acid on the pharmacokinetics of nifedipine in rats. METHODS： Rats were randomly divided into experimental group and control group， with 10 rats in each group. Experimental group was given glycyrrhizic acid 5 mg/kg and control group was given 0.5% CMC-Na （sodium carboxymethylcellulose） solution， once a day， for 14 consecutive days. On 14th day after 30 min of intragastric administration， both groups were given nifedipine 3 mg/kg intragastrically. Blood samples 0.5 mL were collected from intraocular vein plexus before and at 0.25， 0.5， 0.75， 1， 1.5， 2， 3， 4， 6， 8， 12 and 24 h after intragastric administration. The concentration of nifedipine was determined by HPLC using diazepam as internal standard. The determination was performed on ODS-C18 column with mobile phase consisted of methanol-water （62 ∶ 38， ? ? V/V，pH adjusted to 4.5 with acetic acid） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃. The detection wavelength was set at 238 nm， and sample size was 20 μL. The pharmacokinetic parameters were calculated with Winonlin 6.0 software， and statistical analysis was performed by t-test. RESULTS： The main pharmacokinetic parameters of the experimental group and the control group were as follows as tmax was （1.40±0.15）， （1.50±0.01） h; cmax was （0.15±0.03）， （0.29±0.09） ? ? ?mg/L; t1/2 was （4.70±1.17）， （5.20±1.38） h; AUC0-24 h were （1.00±0.10）， （1.89±0.37） mg·h/L; AUC0-∞ was （1.00±0.16）， （1.98±0.32） mg·h/L; MRT was （6.76±0.64）， （6.60±1.36） h， respectively. Compared with control group， cmax， AUC0-24 h and AUC0-∞ of nifedipine were decreased significantly in experimental group， with statistical significance （P<0.05）. CONCLUSIONS： Glycyrrhizic acid can reduce the bioavailability of nifedipine in rats. It is suggested that the dosage of nifedipine should be increased in order to achieve effective blood concentration.

KEYWORDS ? Glycyrrhizic acid; Nifedipine; Diazepam; HPLC; Pharmacokinetics; Rat

硝苯地平是當今治療心腦血管疾病最常見的一線藥物，主要用于高血壓、心律失常、心絞痛等病的治療。該藥在發揮藥效的同時，常常會引起轉氨酶升高、黃疸等藥物性肝損傷[1]。甘草是一種歷史悠久、應用廣泛的中藥，在方劑中常作為使藥，有“無甘草不成方”之說，在中醫經方《傷寒論》一百一十三方中，多達七十七方含有甘草[2]。甘草中的主要活性物質甘草酸不僅在心血管疾病的防治方面具有非常重要的作用[3]，還是常規的保肝藥物，臨床上常用來治療硝苯地平等藥物引起的肝損傷[4]。本實驗初步探討了甘草酸對大鼠體內硝苯地平藥動學的影響，以期為臨床合理應用甘草酸制劑治療硝苯地平引起的肝損傷提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20高效液相色譜儀（包括LC-20A真空在線脫氣機、LC-20AT四元泵、CTO-10 AS柱溫箱、 SPD-M20 A檢測器）和AUY120電子天平均購自日本Shimadzu公司;5427R離心機（德國艾本德公司）;VX-Ⅲ渦旋混合器（北京踏錦科技有限公司）;BF-2000氮氣吹干儀（北京八方世紀科技有限公司）;HPX-9052MBE恒溫烘箱（上海博訊醫療設備廠）。

1.2 藥品與試劑

地西泮對照品（內標，美國Sigma-Aldrich公司，批號：439-14-5，純度：99.7%）;甘草酸對照品和硝苯地平對照品（阿拉丁公司，批號：1405-86-3、21829-25-4，純度：99.73%、99.76%）;甲醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：67-56-1，色譜級）;羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，批號：C8621-25g）和肝素鈉（批號：9041-08-1）均購自北京索萊寶科技有限公司;乙酸乙酯和環已烷均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

SD大鼠，SPF（無特定病原體）級，♀，2月齡，體質量（210±20） g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK（皖）2017-006。所有大鼠飼養在溫度、濕度、燈光受調控的房間，給予正常飲食，在標準環境飼養2周后開始實驗。

2 方法與結果

2.1 分組與給藥

將大鼠隨機分成對照組和實驗組，每組10只。實驗組大鼠灌胃甘草酸5 mg/kg[5]（溶劑為0.5%CMC-Na溶液，給藥劑量按臨床成人常用劑量換算），對照組大鼠灌胃等量的0.5%CMC-Na溶液，每日1次，連續14 d。第13天夜里，將大鼠禁食過夜（晚上10：00-第2天白天實驗前），但是自由飲水，于第14天灌胃30 min后，實驗組和對照組大鼠同時灌胃硝苯地平3 mg/kg[6]（溶劑為0.5%CMC-Na溶液，給藥劑量按臨床成人常用劑量換算）。

2.2 樣品采集

分別于給予硝苯地平前和給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h從眼內眥取血0.5 mL，置于預先加入肝素鈉的試管中，4 ℃下3 000 r/min離心10 min， -20 ℃冷凍保存備用。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取硝苯地平對照品3.0 mg，置于10 mL量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，得到質量濃度為0.3 mg/mL的硝苯地平貯備液。準確稱取甘草酸對照品10.0 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，得到質量濃度為1.0 ? mg/mL的甘草酸貯備液。上述溶液均置于冰箱2～8 ℃保存備用。

2.3.2 內標溶液的制備 精密稱取地西泮對照品1.00 mg，置于100 mL量瓶中，用適量甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，得到質量濃度為10.0 μg/mL的內標貯備液。精密量取內標貯備液1.00 mL，置于100 mL量瓶中，用適量甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，得到質量濃度為100 ng/mL的內標溶液，置于冰箱2～8 ℃保存備用。

2.4 血漿樣品的處理

精密量取待測血漿樣品200 μL，置于1.5 mL EP管中，加入10 μL內標溶液（100 ng/mL），加入乙酸乙酯-環己烷混合液（3 ∶ 1，V/V）[7]1 mL萃取，渦旋1 min，4 000 ? ? r/min離心5 min。取上清液0.8 mL，置于干凈的EP管中，55 ℃水浴加熱，N2吹干，并將殘余物用100 μL流動相復溶，取20 μL上清液進樣分析。

2.5 色譜條件

色譜柱：ODS-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：甲醇-水（62 ∶ 38，V/V，乙酸調pH為4.5）;流速：1.0 mL/min;柱溫：30 ℃;檢測波長：238 nm;進樣量：20 μL。

2.6 專屬性試驗

取空白血漿、加硝苯地平的空白血漿、大鼠灌胃后12 h時的給藥血漿各1份，按照“2.4”項下方法處理后（其中空白血漿不加內標溶液），再按照“2.5”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。結果顯示，硝苯地平和地西泮的保留時間分別為9.6、5.9 min，血漿里的雜質不影響硝苯地平的測定，硝苯地平和地西泮可以完全分離，峰形良好，可見本方法具有專屬性高、分離度好的特點，可以準確測定硝苯地平的濃度。色譜圖見圖1。

2.7 線性關系與定量下限的考察

將200 μL空白血漿，置于離心管中，加入10 μL內標溶液（100 ng/mL），再分別加入50 μL不同質量濃度的硝苯地平對照品溶液至終濃度分別為20、40、80、160、320 ng/mL。再按照“2.4”項下方法處理后（不再加內標溶液），按“2.5”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以硝苯地平質量濃度為橫坐標（x），以硝苯地平與內標峰面積比值的均數為縱坐標（y），采用加權最小二乘法進行線性回歸分析，得回歸方程為y=0.011x-0.006 6（r=0.999 4），硝苯地平的檢測質量濃度在20～320 ng/mL線性范圍內與峰面積呈良好的線性關系。以信噪比值=10確定的定量下限為5 ng/mL。

2.8 精密度、準確度、穩定性試驗

將200 μL空白血漿，分別加入不同質量濃度的硝苯地平對照品溶液至終濃度分別為20、80、320 ng/mL。按照“2.4”項下方法處理后，按“2.5”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，每個濃度同日內測定5次，考察日內精密度;連續測定3 d考察日間精密度;以測得值與真實值的比值計算準確度。分別放置0、1、2、3、6、12、24 h后再按照“2.4”項下方法處理，然后按“2.5”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，考察穩定性。結果顯示，20、80、320 ng/mL血漿樣品的日內、日間精密度的RSD和穩定性的RSD均小于10%（n=5或n=7），準確度在80%～120%之間，RSD均小于10%（n=5），表明本方法精密度、準確度、穩定性考察均符合相關要求。精密度、準確度、穩定性結果見表 1。

2.9 藥動學研究

取“2.2”項下各采血時間點的血漿，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.5”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，代入回歸方程計算硝苯地平濃度，繪制2組大鼠體內硝苯地平的藥-時曲線。再采用Winonlin 6.0軟件通過非房室模型分析計算藥動學參數。 其中，tmax和cmax是實測值，AUC0-24 h由前24 h每個時間點的血藥濃度通過梯形法計算得到，AUC0-∞=AUC0-24 h+c24 h/λ（c24 h是最后24 h的血藥濃度，λ是末端消除速度常數，即藥-時曲線末端直線部分的斜率），t1/2=0.693/λ，平均滯留時間（MRT）=AUMC/AUC（AUMC是指一階距藥-時曲線下面積）。采用SPSS 13.0軟件對兩組大鼠的藥動學參數進行t檢驗。兩組大鼠體內硝苯地平的藥-時曲線見圖2，藥動學參數比較見表2。

由表2結果可見，兩組大鼠體內硝苯地平的tmax、t1/2、MRT差異均無統計學意義（P>0.05）。而實驗組大鼠體內硝苯地平的cmax、AUC0-24 h、AUC0-∞均明顯低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

當今社會，臨床上中西藥結合治療已成常態。中西藥聯用可以發揮各自優勢，取長補短，提高療效，但也會不可避免地因兩者發生相互作用從而引起一系列不良反應，其中代謝酶的改變是最主要因素之一。硝苯地平為肝臟主要代謝酶細胞色素P450（CYP）3A4的底物[8]，而甘草酸會誘導CYP3A4的活性[9]，所以甘草酸有可能會對硝苯地平的藥動學產生影響。

有文獻[10]記載大鼠的性別對CYP3A4酶影響很大，考慮到雌鼠的CYP3A4代謝與人類更接近，所以本實驗均以雌性的SD大鼠作為藥動學研究的模型。實驗結果表明，與對照組比較，硝苯地平聯用甘草酸后，硝苯地平的AUC0-24 h降低34.6%、AUC0-∞降低34.7%，并伴隨著cmax的輕度降低（22.8%），差異均具有統計學意義（P<0.05），提示硝苯地平在體內的代謝過程發生改變，血藥濃度出現明顯下降，這可能與甘草酸是CYP3A4的誘導劑有關。Lee KJ等[11]使用平衡透析法進行了蛋白質結合研究，發現加入甘草酸后，主要影響了硝苯地平與人血清白蛋白（HSA）的結合，從而使硝苯地平與血清的結合發生位移，血清K值降低。然而甘草酸的使用并沒有使硝苯地平的tmax、t1/2、MRT發生明顯變化，這可能與甘草酸對機體CYP系統影響較為復雜有關。CYP2C是CYP家族重要的一員，約占大鼠CYP總量的55%，參與很多藥物代謝。張瑛瑛[12]指出甘草酸對大鼠CYP3A4、CYP2B1、CYP1A2等具有誘導作用，對人的CYP2C19活性卻沒有影響。但甘草次酸卻可以明顯抑制CYP2C9和CYP2C19的活性。所以筆者猜測，tmax、t1/2、MRT未發生明顯變化的原因可能是甘草酸對CYP2B1、CYP1A2等其他酶也產生了影響，也可能是甘草酸灌胃給藥后在大鼠體內生成了主要的活性成分甘草次酸，而甘草次酸進一步影響了其他代謝酶的活性。

總之，甘草酸改變了硝苯地平的代謝，對硝苯地平的藥動學產生了影響。提示兩者配伍時應適當增加硝苯地平的用量，使之維持有效的血藥濃度。筆者后期將進一步考察更長誘導時間、更大劑量甘草酸可能對硝苯地平帶來的影響，而且由于甘草酸對機體CYP代謝酶系統影響較為復雜，甘草酸影響硝苯地平的藥動學機制也有待于繼續深入研究。

參考文獻

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（收稿日期：2019-05-30 修回日期：2019-09-17）

（編輯：鄒麗娟）