馬海治癱膠囊的HPLC指紋圖譜及其5個成分含量測定研究

劉滿軍 崔小敏 石會麗 王曉萍 陳志永 牛安琦 高蓉 曹小平

中圖分類號 R284 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）21-2980-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.21.20

摘 要 目的：建立馬海治癱膠囊的指紋圖譜，并測定其中主要成分的含量，為其制劑工藝的穩定性及質量控制提供科學依據。方法：采用Inertsil ODS-3色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，檢測波長為250 nm（0～23 min和31～120 min）、230 nm（23～31 min），柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min。應用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件”（2012版）建立10批馬海治癱膠囊的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜并進行相似度評價，分別以對照藥材、缺味藥材陰性樣品和對照品對色譜峰進行歸屬和指認，并對指認出的主要成分進行定量分析。結果：10批樣品的相似度均在0.99以上，共確定了20個共有峰，并指認了其中10個色譜峰。其中，1、13、14、15、16、17、18、19、20號色譜峰來源于大黃，3、4、6、7號色譜峰來源于制馬錢子，8號色譜峰來源于當歸，2、5、9、10、11、12號色譜峰未發現相應的藥材來源;通過與對照品比對，指認了1、4、6、7、8、16、17、18、19、20號色譜峰分別為沒食子酸、馬錢苷酸、士的寧、馬錢子堿、阿魏酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚。在對指認出的5個主要成分（馬錢苷酸、士的寧、馬錢子堿、大黃素和大黃酚）的含量測定中，方法學考察均符合相關標準，10批樣品中馬錢苷酸、士的寧、馬錢子堿、大黃素和大黃酚含量分別為2.477 1～2.785 9、1.746 1～1.946 0、1.374 6～1.505 8、1.573 2～1.824 1和0.232 1～0.261 7 mg/g。結論：建立的方法可靠、準確、穩定、簡便，可作為馬海治癱膠囊的制劑工藝與質量監控依據。

關鍵詞 馬海治癱膠囊;指紋圖譜;含量測定;高效液相色譜法

Study on HPLC Fingerprint and Content Determination of 5 Components in Mahai Zhitan Capsule

LIU Manjun1，CUI Xiaomin2，SHI Huili1，WANG Xiaoping1，CHEN Zhiyong2，NIU Anqi1，GAO Rong1，CAO Xiaoping1（1.Dept. of Preparation， Shaanxi Provincial Hospital of TCM， Xi’an 710003， China;2.Shaanxi Provincial Academy of TCM， Xi’an 710068， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the fingerprint of Mahai zhitan capsule， to determine the contents of main components， and to provide scientific basis for the stability and quality control of the preparation technology. METHODS： The determination was performed on Inertsil ODS-3 column with acetonitrile-0.1% phosphoric acid as mobile phase （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 250 nm （0-23 min and 31-120 min） and 230 nm （23-31 min）. The column temperature was set at 30 ℃. HPLC fingerprint for 10 batches of Mahai zhitan capsule was established by using “similarity evaluation software for chromatographic fingerprint of traditional chinese medicine” （2012 edition） and the similarity was evaluated. The chromatographic peaks were assigned and identified with reference substance， negative samples without ingredient and substance control respectively， and the identified main components were quantitatively analyzed. RESULTS： The similarity of 10 batches of sample was more than 0.99; 20 common peaks were found， and 10 common peaks were identified. Among them， No. 1，13，14，15，16，17，18，19，20 chromatographic peaks originated from Rheum palmatum; No. 3，4，6，7 chromatographic peaks originated from processed Strychnos nuxvomica; No. 8 chromatographic peaks originated from Angelica sinensis; the corresponding source of medicinal materials was not found in No. 2，5，9，10，11，12 chromatographic peaks. By comparing the reference substances， No. 1，4，6，7，8，16，17，18，19 and 20 chromatographic peaks were identified as gallic acid， loganin acid， strychnine， brucine， ferulic acid， aloe-emodin， rhein， emodin， chrysophanol and emodin methyl ether， respectively. In the determination of identified five main components （loganin， strychnine， brucine， emodin and chrysophanol）， the methodological investigation met the relevant standards. In 10 batches of samples， the contents of loganin， strychnine， brucine， emodin and chrysophanol were 2.477 1-2.785 9， 1.746 1-1.946 0， 1.374 6-1.505 8， 1.573 2-1.824 1 and 0.232 1-0.261 7 mg/g， respectively. CONCLUSIONS： The established method is reliable， accurate， stable and simple， which could provide reference for the preparation technology and quality control of Mahai zhitan capsule.

KEYWORDS Mahai zhitan capsule; Fingerprint; Content determination; HPLC

馬海治癱膠囊是本院（即陜西省中醫院）腦內科前輩依據中醫陰陽平衡理論創立的具有中醫藥特色的制劑方之一，由黃芪、大黃、制馬錢子、水蛭、當歸、海風藤、千年健等七味藥組成，具有益氣通絡、活血化瘀、醒腦開竅和健肢回語的功效，其在臨床使用了四十余年，治療軟癱中風病的總有效率達95%以上[1-2]。相關藥理研究也表明，馬海治癱膠囊不僅具有延長小鼠缺氧存活時間、延長凝血時間以及有效改善機體微循環的作用，并能顯著改善神經功能癥狀和行為學障礙、減輕腦水腫程度、縮小腦梗死面積[3-4]。但目前，該制劑質量標準僅有大黃和黃芪的薄層鑒別[5]，無法全面控制藥品的質量，更無法全面闡釋本制劑治療中風疾病的物質基礎及其多靶點治療的整體性和復雜性內涵。基于此，本研究采用高效液相色譜（HPLC）法建立馬海治癱膠囊的指紋圖譜，確認指紋特征峰物質，同時對方中二味君藥制馬錢子與大黃中含有的馬錢苷酸、士的寧、馬錢子堿、大黃素和大黃酚5個成分建立含量測定方法，為馬海治癱膠囊制劑工藝穩定性考察和質量評價與控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260 Infinity HPLC儀（美國Agilent公司）;KQ-100超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）;BT25S電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司，d=0.01 mg）。

1.2 藥品與試劑

10批馬海治癱膠囊均由本院制劑室制備（批號：2017060101、2017060102、2017060103、2017060104、2017060105、 2017060106、2017060107、2017060108、2017060109、2017060110，依次編號為S1～S10，規格：0.3 g/粒，每1 g中含生藥量2.91 g）;藥材黃芪、大黃、制馬錢子、水蛭、當歸、海風藤、千年健（陜西興盛德藥業有限責任公司，批號：20170101、20170203、20170206、20170210、20170311、20170306、20170216），經陜西省中醫醫院石會麗研究員鑒定均符合藥典標準;對照品馬錢苷酸（批號：MUST-18040209，純度：99.52%）、士的寧（批號：MUST-16053101，純度：99.51%）、馬錢子堿（批號：MUST-16041906，純度：99.31%）、蘆薈大黃素（批號：MUST-17030605，純度：98.65%）、大黃素（批號：MUST-16110712，純度：99.10%）、大黃素甲醚（批號：MUST-17030622，純度：99.21%）均購自成都曼斯特生物科技有限公司;對照品阿魏酸（批號：0757-9804，純度：99.41%）、大黃酚（批號：0796-20006，純度：98.61%）、大黃酸（批號：0757-9804，純度：98.65%）均購自中國食品藥品檢定研究院;對照品沒食子酸為自制（批號：20180201，純度：99.1%）;乙腈（美國Honeywell公司，色譜純）;甲酸（天津市科密歐化學試劑有限公司，分析純）;甲醇（成都市科隆化學品有限公司，分析純）;磷酸（國藥集團化學有限責任公司，分析純）;其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 馬海治癱膠囊指紋圖譜的研究

2.1.1 色譜條件

色譜柱為Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱溫為30 ℃;流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸（B）溶液，梯度洗脫（0～10 min，5%A;10～70 min，5%→30%A;70～120 min，30%→100%A）;檢測波長為250 nm（0～23 min和31～120 min）、230 nm（23～31 min）;流速為1.0 mL/min;進樣量為10 μL。

2.1.2 溶液的制備

（1）供試品溶液的制備。取馬海治癱膠囊內容物1.0 g，精密稱定，置于50 mL具塞三角瓶中，加75%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲（頻率：250 W、40 kHz）30 min，放至室溫;再次稱定質量，用75%甲醇補足減失的質量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液，即得。

（2）單味藥材樣品溶液的制備。分別取7種單味藥材粉末0.5 g，精密稱定，依照“2.1.2（1）”項下供試品溶液的制備方法，制得各單味藥材樣品溶液。

（3）對照品溶液的制備。精密稱取各對照品適量，分別置于10 mL量瓶中，用75%甲醇溶解并定容至刻度，制成每1 mL分別含沒食子酸0.80 mg、馬錢苷酸0.456 mg、士的寧0.15 mg、馬錢子堿0.15 mg、阿魏酸0.21 mg、蘆薈大黃素0.203 mg、大黃酸0.091 mg、大黃素0.475 mg、大黃酚0.36 mg和大黃素甲醚0.11 mg的單一對照品溶液。

（4）缺味藥材陰性樣品溶液的制備 ?按處方比例分別稱取其中6味藥材，照制劑工藝制得缺味藥材陰性樣品，再按“2.1.2（1）”項下方法分別制得各藥材的缺味藥材陰性樣品溶液。

2.1.3 指紋圖譜建立的方法學考察

（1）精密度試驗。精密稱取馬海治癱膠囊（批號：2017060104）內容物1.0 g，采用“2.1.2（1）”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6次，以峰19為參照峰（峰面積居中、分離度良好），計算得到各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.02%（n=6）、 相對峰面積的RSD均小于2.0%（n=6），表明儀器精密度良好。

（2）重復性試驗。取同一批馬海治癱膠囊（批號：2017060104）內容物1.0 g，精密稱定，平行6份，采用“2.1.2（1）”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以峰19為參照峰計算得到各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.99%（n=6）、相對峰面積的RSD均小于3.01%（n=6），表明該方法重復性良好。

（3）穩定性試驗。取同一供試品溶液（樣品批號：2017060104），分別在室溫放置0、2、4、8、12、24 h后，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以峰19為參照峰計算得到各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.83%（n=6）、相對峰面積的RSD均小于2.02%（n=6），表明樣品溶液在室溫放置24 h穩定。

2.1.4 HPLC指紋圖譜的建立與分析

（1）馬海治癱膠囊HPLC指紋圖譜的生成。分別按“2.1.2（1）”項下方法制備10批馬海治癱膠囊的供試品溶液后，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄10批馬海治癱膠囊的色譜圖。將所得圖譜文件轉換成“AIA”格式，批量導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件”（2012版）中，以S9譜圖為參照圖譜，將時間窗設為0.3 min，采用多點校正法進行色譜峰匹配，選擇中位數法生成對照指紋圖譜。對照指紋圖譜和10批馬海治癱膠囊的HPLC指紋圖譜見圖1。

（2）相似度評價及共有指紋圖譜的標定。因峰19（大黃素）峰面積居中、分離度良好，因此作為參照峰，標定20個峰的相對保留時間及峰面積大小，并采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件”（2012版），以對照指紋圖譜R為參照，進行整體相似度評價。結果顯示，10批馬海治癱膠囊的相似度均大于0.99，說明不同批次間樣品的相似度較高，其生產工藝相對穩定。10批馬海治癱膠囊共有峰的相對保留時間見表1，相對峰面積見表2，相似度評價結果見表3。

（3）共有峰的歸屬。取各單味藥材溶液、缺味藥材陰性樣品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖，通過色譜峰對比，對馬海治癱膠囊指紋圖譜中20個共有峰進行歸屬。結果發現，馬海治癱膠囊20個共有峰中的1、13、14、15、16、17、18、19、20號色譜峰來源于大黃;3、4、6、7號色譜峰來源于制馬錢子;8號色譜峰來源于當歸;但2、5、9、10、11、12號色譜峰沒有找到相應的藥材來源，可能是在制劑制備過程中新產生的成分。各單味藥材溶液與缺味藥材藥品溶液的色譜圖見圖2。

（4）色譜峰的指認。將對照品溶液按“2.1.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖，通過色譜峰對比，對馬海治癱膠囊中主要的共有峰進行指認。結果，指認了1、4、6、7、8、16、17、18、19、20號色譜峰分別為沒食子酸、馬錢苷酸、士的寧、馬錢子堿、阿魏酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚，對照品色譜圖見圖3。

2.2 馬海治癱膠囊中5個成分的含量測定

2.2.1 溶液的制備

（1）混合對照品溶液的制備。分別取馬錢苷酸、士的寧、馬錢子堿、大黃素和大黃酚對照品適量，精密稱定，置于同一10 mL棕色量瓶中，用適量75%的甲醇溶解后定容至刻度，制成每1 mL含馬錢苷酸0.074 54 mg、士的寧0.120 35 mg、馬錢子堿0.106 36 mg、大黃素0.035 33 mg、大黃酚0.094 5 mg的混合對照品溶液。

（2）供試品溶液的制備。制備方法同“2.1.2（1）”項下。

2.2.2 色譜條件與系統適用性試驗

取混合對照品溶液和供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖。結果，各待測峰與相鄰峰間的分離度均大于1.5，理論板數以馬錢苷酸峰計為100 185，以士的寧峰計為56 395，以馬錢子堿峰計為111 486，以大黃素峰計為1 168 203，以大黃酚峰計為 ? 1 131 014，色譜圖見圖4。

2.2.3 含量測定方法學考察及結果

（1）線性關系考察。精密吸取“2.2.1（1）”項下混合對照品溶液2、4、8、12、16和20 μL，在“2.1.1”項下色譜條件下進樣分析，記錄色譜圖并測定峰面積。以進樣量為橫坐標（x， μg）、峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線，得到馬錢苷酸的回歸方程為y=1 097.8x-4.714 5（r=0.999 8），士的寧的回歸方程為y=2 129.1x-35.112（r=0.999 6），馬錢子堿的回歸方程為y=1 152.5x+6.378 4（r=0.999 9），大黃素的回歸方程為y=13 070x+19.5（r=0.999 7），大黃酚的回歸方程為y=855.38x-3.030 4（r=0.999 6），表明馬錢苷酸、士的寧、馬錢子堿、大黃素和大黃酚分別在進樣量為0.149 1～1.491、0.240 7～2.407、0.212 7～2.127、0.070 1～0.701、0.189～1.89 μg范圍內與其各自峰面積線性關系良好。

（2）檢測限與定量限試驗。取混合對照品溶液逐級稀釋，分別以信噪比（S/N）為3和10時的對照品質量濃度為檢測限和定量限。結果，馬錢苷酸、士的寧、馬錢子堿、大黃素和大黃酚的檢測限分別為1.19×10-4、1.60×10-4、2.13×10-4、2.36×10-4、3.15×10-4 μg，定量限分別為3.58×10-4、4.81×10-4、6.38×10-4、7.07×10-4、9.45×10-4 μg。

（3）精密度試驗。精密吸取同一混合對照品溶液10 μL，在“2.1.1”項下色譜條件下重復進樣測定6次，測得馬錢苷酸、士的寧、馬錢子堿、大黃素和大黃酚的峰面積RSD分別為1.15%、0.62%、0.89%、1.20%、1.19%（n=6），表明儀器精密度良好。

（4）重復性試驗。精密稱取同一批馬海治癱膠囊粉末 （批號：2017060104）6份，按“2.2.1（2）”項下方法制備成供試品溶液，在“2.1.1”項下色譜條件下進樣分析，計算得馬錢苷酸、士的寧、馬錢子堿、大黃素和大黃酚的平均含量分別為2.436 2、1.925 7、1.413 2、1.667 5、0.236 5 mg/g，RSD分別為1.68%、1.35%、0.96%、1.64%、0.62%（n=6），表明該方法重復性良好。

（5）穩定性試驗。取“2.2.1（2）”項下同一供試品溶液（批號：2017060104），室溫放置0、2、4、6、8、12 h后，分別按“2.1.1”項下色譜條件下進樣分析，計算得馬錢苷酸、士的寧、馬錢子堿、大黃素和大黃酚峰面積的RSD分別為0.50%、0.94%、1.81%、1.43%、0.52%（n=6），表明供試品溶液室溫放置12 h穩定。

（6）加樣回收試驗。精密稱取已知含量的馬海治癱膠囊粉末（批號：2017060104） 0.5 g，共稱取6份，置于具塞三角瓶中，分別按待測成分質量比為1 ∶ 1的比例加入相應對照品溶液，按“2.2.1（2）”項下方法制備供試品溶液后，按“2. 1.1”項下色譜條件下進樣分析，測定其含量并計算其回收率。結果，5個成分的平均回收率為98.88%～100.31%，RSD為0.71%～1.31%（n=6）。回收率測定結果見表4。

（7）樣品含量測定。取10批馬海治癱膠囊樣品粉末各1.0 g，精密稱定，按“2.2.1（2）”項下方法制備供試品溶液后，按“2.1.1”項下色譜條件下進樣分析，計算得馬錢苷酸、士的寧、馬錢子堿、大黃素和大黃酚的含量分別為2.477 1～2.785 9、1.746 1～1.946 0、1.374 6～1.505 8、1.573 2～1.824 1和0.232 1～0.261 7 mg/g，結果見表5。

3 討論

3.1 色譜條件優選

在前期研究中，筆者參考文獻報道[6-8]，分別對不同色譜柱[Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]和不同流動相系統（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸、乙腈-磷酸）以及不同柱溫（25、30、35 ℃）進行了考察，結果分別以Inertsil ODS-3為色譜柱、乙腈-磷酸為流動相系統以及在柱溫為30 ℃時的分離效果最好。

3.2 檢測波長和溶劑的優選

在單一檢測波長下，很難反映一個復方中藥制劑所有成分的特征，因此在本研究中選擇 DAD檢測器在190～400 nm波長范圍內進行掃描。結果發現，在230 nm和250 nm波長下指紋圖譜的色譜峰數量最多且峰形好、峰高度合適，呈現良好的色譜圖，再結合參考文獻[9-13]反復試驗后，摸索得此復方樣品23～31 min時間段在波長230 nm下色譜峰信號更強，故在本研究中采用切換波長法，設置23～31 min時間段的檢測波長為230 nm，其余檢測時段的波長均為250 nm。在前期研究中，筆者參考文獻[14-16]選擇以甲醇為溶劑制備對照品溶液，但在試驗中發現，士的寧和馬錢子堿在設定色譜條件下峰形分叉。根據筆者以往經驗，分析這可能是由于對照品溶劑甲醇與起始流動相極性相差太大所致，改為75%甲醇后峰形即對稱、良好，故最終以75%甲醇作為制備對照品與供試品溶液的溶劑。

3.3 指紋圖譜及含量測定分析

本研究建立的馬海治癱膠囊HPLC指紋圖譜，共得到了20個共有峰，且共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%，差異較小。通過與混合對照品溶液、組方單味藥材提取溶液及缺味藥材陰性藥品溶液色譜圖的對比，最終確定了14個特征峰的藥材來源歸屬和10個特征峰的化學成分歸屬。但是海風藤、水蛭、黃芪、千年健這四味藥材在此檢測條件下信號較弱，未發現其對應的特征峰，希望在后期的研究中對此有所突破。

另外，方中馬錢子具有益氣強肌、扶助正氣、解毒散結、通絡化瘀的功效，主要有效成分為生物堿類（如士的寧、馬錢子堿、馬錢苷酸等），含量為2%～5% ，其中士的寧和馬錢子堿占總生物堿的80%，既是馬錢子最主要的有效成分也是毒性成分[17]。藥理研究也顯示，馬錢子所含成分有改善微循環作用，體內給藥后能抗血栓形成[5]。方中大黃有“滌實痰”作用，其活性成分為大黃素和大黃酚等。本研究建立了二味君藥中性質穩定、含量較高的馬錢苷酸、士的寧、馬錢子堿、大黃素、大黃酚的含量，經過儀器精密度、方法重復性和穩定性考察，表明本研究建立的馬海治癱膠囊指紋圖譜與含量測定方法重復性好，方法可靠，并可簡便快速測定有效物質的含量，可以為控制其工藝穩定與評價質量優劣提供有效的方法保證。

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（收稿日期：2019-03-21 修回日期：2019-08-12）

（編輯：林 靜）