二氫丹參酮對人非霍奇金淋巴瘤Raji細胞增殖、凋亡的影響及機制

陳亮 董長城

摘要?目的：探究二氫丹參酮對人非霍奇金淋巴瘤Raji細胞增殖、凋亡的影響及機制。方法：體外培養人非霍奇金淋巴瘤Raji細胞，并分為空白組和低/高劑量組，低/高劑量組以8、15 μmol/L二氫丹參酮處理，空白組以等量0.9%氧化鈉注射液處理。用CCK-8法檢測Raji細胞成活率，Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測各組Raji細胞凋亡情況，試劑盒檢測細胞中Caspase 8活性，免疫熒光法檢測Raji細胞中CytC移位情況，蛋白免疫印跡法檢測Raji細胞中Bad、Bax蛋白表達。結果：低/高劑量組藥物干預24、48 h后細胞成活率及增殖指數低于空白組，差異有統計學意義（P<0.05）。干預48 h后，低/高劑量組Raji細胞凋亡率、Caspase 8活性及CytC表達量高于空白組，差異有統計學意義（P<0.05）。與空白組比較，低/高劑量組Bad蛋白表達升高，差異有統計學意義（P<0.05），Bax蛋白表達量差異無統計學意義（P>0.05）。結論：二氫丹參酮可有效抑制人非霍奇金淋巴瘤Raji細胞增殖，并誘導其發生凋亡，其作用機制與上調Caspase8的表達，誘導Bad表達有關，且呈劑量依賴性。

關鍵詞?非霍奇金淋巴瘤;二氫丹參酮;增殖;凋亡;機制

Effects of Dihydrotanshinone on Proliferation and Apoptosis of Human Non-Hodgkin′s Lymphoma Raji Cells and its Mechanism

Chen Liang， Dong Changcheng

（Steel Hospital of Baotou City， Baotou 014010， China）

Abstract?Objective：To investigate the effects of dihydrotanshinone on proliferation and apoptosis of human non-Hodgkin lymphoma Raji cells and its mechanism.Methods：Raji cells of human non-Hodgkin′s lymphoma were cultured in vitro and divided into a blank group and a low/high dose experimental group.The experimental group was treated with 8， 15 μmol/L dihydrotanshinone， and the blank group was treated with 0.9% NaCL.CCK-8 method was used to detect the survival rate of Raji cells， and Annexin V-FITC/PI double-staining flow cytometry was used to detect the apoptosis of Raji cells in each group.Caspase 8 activity was detected by kit， and Cytc translocation in Raji cells was detected by immunofluorescence， and Bad and Bax protein expression in Raji cells was detected by Western blotting.Results：The cell viability and proliferation index of low/high dose experimental group were lower than those of the blank group after 24 and 48 hours of drug intervention（P<0.05）.After 48 hours of intervention， Raji cell apoptosis rate， Caspase 8 activity and Cytc expression in the low/high dose experimental group were higher than those in the blank group（P<0.05）.WB detection showed that compared with the blank group， the expression of Bad protein in the low/high dose experimental group increased（P<0.05）， and the expression of Bax protein had no significant difference（P>0.05）.Conclusion：Dihydrotanshinone can effectively inhibit the proliferation and induce apoptosis of Raji cells in non-Hodgkin′s lymphoma， and its mechanism is related to up-regulation of Caspase 8 expression and Bad expression， and with dose-dependence.

Key Words?Human non-Hodgkin′s lymphoma; Dihydrotanshinone; Proliferation; Apoptosis; Mechanism

中圖分類號：R284;R733文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.023

非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin′s Lymphoma，NHL）是惡性淋巴瘤（Malignant Lymphoma，ML）的一種，占比達85%～90%，是一種具有高度侵襲性的血液系統惡性腫瘤，疾病進展迅速，較早發生遠處擴散和結外侵襲，而單純化療治療效果不佳[1-2]。從中草藥資源中尋找新的活性化合物，提高患者的化療敏感性、改善患者預后生命質量是目前臨床研究的熱點。二氫丹參酮屬于菲醌類脂溶性化合物，其抗菌活性顯著，且近年來研究報道，其可通過抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡，但與丹參其他生物學有效成分隱丹參酮、丹參酮Ⅰ及丹參酮ⅡA等比較，抗腫瘤研究尚處于早期階段，且在NHL方面的抗腫瘤效應研究尚不多見[3-4]。本研究重點探討二氫丹參酮對人NHL Raji細胞增殖、凋亡的影響及機制。現報道如下。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?細胞株?人NHL Raji細胞，由中國科學院上海生命科學研究院饋贈。

1.1.2?試劑與儀器

主要試劑：二氫丹參酮（上海源葉生物科技有限公司，批號：YY90060）純度98%;胎牛血清（杭州四季青公司，批號：08040502）;RPMI-1640培養基（美國Gibco公司，批號：AE24464298）;AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號：20170601）;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-8）檢測試劑盒（南京凱基生物公司，批號：BC3880）;Bad、Bax抗體（美國Bioworld公司，批號：AB008、AB009）等。

主要儀器：SHEL-LAB2300型CO2培養箱，美國SHELDON公司產品;LXJ-II型超低溫高速離心機，上海領成生物科技有限公司;IX71型熒光倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司產品;Elx800酶標儀，美國Bio-Tek公司產品;DY-A型穩壓電泳儀，上海西巴斯公司;JY-ZY5型蛋白凝膠電泳轉印系統，美國Bio Rad公司產品等。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備

將Raji細胞采用含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640培養基置于37 ℃ 5% CO2培養箱中培養，每2～3 d離心換液，進行傳代培養，取生長至對數期狀態良好的細胞進行后續實驗研究[5]。

1.2.2?給藥方法

消化細胞后調整細胞密度為2×105/mL，接種于96孔板中，分為空白組和低/高劑量組，每組設6個復孔，低/高劑量組以8、15 μmol/L二氫丹參酮處理，空白組以等量0.9%氧化鈉注射液處理。

1.2.3?檢測指標與方法

CCK-8法檢測Raji細胞成活率：培養24、48 h后取出96孔培養板，每孔加10 μLCCK-8工作液，繼續培養2 h，以酶標儀檢測吸光度值（OD450 nm），計算細胞成活率=（組OD平均值/空白組OD平均值）×100%，重復3次檢測[6]。

Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測各組Raji細胞凋亡情況：于295 μL細胞懸液中加入Annexin V-FITC 5 μL，加入10 μL 10 μg/mL的碘化丙啶（PI），4 ℃避光反應15 min，加入200 μL 4 ℃緩沖液，應用Nex-in程序在guava easy Cyte8微流式細胞分析儀檢測Raji細胞周期及凋亡率，實驗重復3次，計算增殖指數=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）[7]。

Raji細胞內Caspase 8活性檢測：收集作用48 h后的Raji細胞，裂解細胞后收集上清。測定上清中蛋白濃度，采用Caspase-8試劑盒檢測上清中Caspase-8含量，405 nm處測定各組細胞的吸光度值。

免疫熒光法檢測Raji細胞中細胞色素C（CytC）移位情況：取培養于蓋片上生長融合至95%左右的Raji細胞，4%甲醛固定，分別經DAPI、mitotracker Red CMXRos及綠色熒光標記后的CytC抗體孵育染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察Raji細胞中CytC蛋白移位情況[8]。

蛋白免疫印跡法檢測Raji細胞中Bad、Bax蛋白表達：收集干預后48 h細胞，并提取細胞總蛋白，進行蛋白濃度測定，參照相關文獻[7]檢測方法檢測Raji細胞中Bad、Bax蛋白條帶積分吸光度值[9]。

1.3?統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組間比較進行獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2?結果

2.1?各組Raji細胞形態及增殖情況比較

正常組Raji細胞形態規則，貼壁生長，組細胞形態不規則，立體感較差，大量細胞出現圓縮，間隙增加，可見部分細胞碎片。干預24 h后，空白組和低/高劑量組Raji細胞成活率分別為（99.42±0.13）%，（86.34±4.45）%，（78.56±9.73）%，干預48 h后，空白組和低/高劑量組Raji細胞成活率分別為（98.46±0.21）%，（66.47±6.45）%，（48.55±4.43）%，低/高劑量組干預24、48 h細胞活率及增殖指數均低于空白組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2?各組Raji細胞凋亡情況及Caspase-8活性比較

干預48 h后，低/高劑量組Raji細胞凋亡率高于空白組，且高劑量組高于低劑量組（P<0.05）。見表1。

2.3?Raji細胞中Caspase 8活性及細胞色素C（CytC）表達情況

干預48 h后，低/高劑量組Raji細胞Caspase 8活性均高于空白組，且高劑量組高于低劑量組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。低/高劑量組Raji細胞CytC表達量高于空白組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1。

2.4?各組Raji細胞Bad、Bax蛋白表達比較

與空白組比較，低/高劑量組Bad蛋白表達量均升高，差異有統計學意義（P<0.05）。Bax蛋白表達差異無統計學意義（P>0.05）。見圖2，表2。

3?討論

NHL目前治療策略以化療為主，且與常規NHL的化療方案比較，高強度、短療程包含CTX、MTX、Ara-c的各種化療方案效果更佳，另外增加利妥昔單抗更有助于進一步增強療效;但由于疾病的高度惡性和侵襲性，目前臨床整體治療效果仍不令人滿意[10]。從中醫學理論來說NHL起病源于正氣虛損，加之癌毒侵襲，與痰、瘀互結所致。正氣虛損與腎、脾的關系密切，腎為先天之本，《諸病源候論》曰：“腎藏精，精者，血之所成也”。脾為后天之本，《景岳全書》曰：“血者水谷之精也，源源而來，生化于脾”。均說明了腎、脾與氣血、正氣的密切聯系;化療藥物屬于攻邪類藥物，此類藥物在“以毒攻毒”的同時會損傷陰陽氣血及脾、腎等臟，這也是NHL治療中常提到的“攻邪傷正”理論[11-12]。

丹參是具有活血化瘀、益氣安神、涼血消腫的傳統中藥，二氫丹參酮是丹參的抗腫瘤活性成分之一，近年來有關其體外抗腫瘤效應日漸突出，可有效抑制體外培養的卵巢癌細胞A2780[13]、人肝癌細胞[14]的增殖與轉移，但目前有關二氫丹參酮對NHL的抗腫瘤效應研究尚不多見。本研究結果證實，與空白組細胞比較，二氫丹參酮干預后Raji細胞成活率及增殖指數明顯降低，凋亡率明顯升高，證實二氫丹參酮也具有較好的抑制Raji細胞增殖，并誘導其凋亡的作用。外源性凋亡途徑主要由細胞表面死亡受體介導，而內源性凋亡途徑主要由線粒體介導，外源性和內源性凋亡途徑均可引起胞內Caspase-8的活化而導致細胞凋亡的發生。胞內酶原形式的pro-caspase 8經死亡受體與其相應配體結合后被激活，Bad、Bid、Bim等為Bcl-2家族成員，接受胞內死亡信號后激活，與Bax、Bak作用后導致蛋白寡聚并插入線粒體膜，膜通透性改變導致大量CytC移位并釋放，胞質中的Caspase-9前體活化并進而啟動Caspase級聯反應，激活下游的Caspase-3和Caspase-7，完成底物剪切而引起細胞凋亡[15]。孫蓓等[16]研究發現，二氫丹參酮通過下調Bcl-2蛋白的表達、上調Caspase-3蛋白的表達對人肺腺癌GLC-82細胞產生較強的抑制作用，并誘導其凋亡。Lee等[17]發現，二氫丹參酮作用肝癌HepG2細胞后，檢測到細胞內caspase 3、8、9活性增高，Bax表達上調。Ishitsuka等[18]用和厚樸酚誘導多發性骨髓瘤細胞凋亡時，發現胞內caspase 3、7、8、9活性增高，Bad表達上調。

本研究結果顯示，干預48 h后，低/高劑量組Raji細胞Caspase 8活性及CytC表達量均高于空白組，與空白組比較，低/高劑量組Bad蛋白表達量均升高，Bax蛋白表達量無明顯差異。提示二氫丹參酮可有效抑制人NHL Raji細胞增殖，并誘導其發生凋亡，其作用機制與上調Caspase8的表達，誘導Bad表達有關，且呈現一定的劑量依賴性。

參考文獻

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（2019-09-27收稿?責任編輯：楊覺雄）