SD大鼠灌胃鹽酸丙卡巴肼與烏拉坦的多臟器堿性彗星實驗研究

文海若 陳高峰 任璐 毛志慧 宋捷 汪祺

中圖分類號 R965；R979.1；R394.6 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）01-0026-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.01.06

摘 要 目的：通過堿性彗星實驗評價鹽酸丙卡巴肼（PCZ）和烏拉坦（EC）對大鼠不同臟器的DNA損傷效應，驗證多臟器堿性彗星實驗的可行性。方法：取30只SD大鼠按體質量隨機分成6組，每組5只，分別為陰性對照組（超純水）、PCZ 75 mg/kg組、PCZ 150 mg/kg組、EC 400 mg/kg組、EC 800 mg/kg組以及陽性對照組（N-乙基-N-亞硝基脲，40 mg/kg）。大鼠連續灌胃給藥4 d，實驗期間觀察其臨床癥狀并記錄體質量，末次給藥后3 h內處死大鼠，稱肝、腎、肺質量，收集肝、腎、肺及外周血淋巴細胞，制備成單細胞懸液進行堿性彗星實驗。樣本分別經裂解、解旋、電泳、染色等步驟后，使用Komet 6.0軟件進行圖像分析尾DNA含量百分率（尾DNA%）、尾距。結果：與陰性對照組比較，PCZ 75、150 mg/kg組和陽性對照組大鼠給藥4 d后體質量和肝、腎質量均明顯降低（P<0.05或P<0.01），EC 800 mg/kg組大鼠給藥4 d后僅體質量明顯降低（P<0.05或P<0.01），其余差異均無統計學意義（P>0.05）。與陰性對照組比較，PCZ 75、150 mg/kg組和陽性對照組大鼠肝、腎、肺和外周血淋巴細胞的尾DNA%和尾距均明顯增加（P<0.05或P<0.01），其中PCZ對肝、肺的影響程度更明顯；EC 800 mg/kg組大鼠肝、腎和外周血淋巴細胞的尾DNA%和尾距均明顯增加（P<0.05或P<0.01），EC 400 mg/kg組大鼠僅腎組織的尾DNA%和尾距明顯增加（P<0.05）。結論：PCZ誘導的細胞DNA損傷較強，肝和肺是其遺傳毒性作用的易感器官；EC誘導的細胞DNA損傷相對較弱，腎是其遺傳毒性作用最敏感的器官。

關鍵詞 堿性彗星實驗；體內遺傳毒性；鹽酸丙卡巴肼；烏拉坦；SD大鼠

Study of Alkaline Comet Assay at Various Tissues in SD Rats with Intragastric Administration of Procarbazine Hydrochloride and Ethyl Carbamate

WEN Hairuo，CHEN Gaofeng，REN Lu，MAO Zhihui，SONG Jie，WANG Qi（National Institute for Food and Drug Control， Beijing 100050， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To evaluate the DNA damage response of procarbazine hydrochloride （PCZ） and ethyl carbamate （EC） to different tissues in rats by performing alkaline comet assay， to validate the feasibility of alkaline comet assay of various tissues. METHODS： Totally 30 SD rats were randomly divided into 6 groups according to body weight， with 5 rats in each group， such as negative control group （hyperpure water）， PCZ 75 mg/kg group， PCZ 150 mg/kg group， EC 400 mg/kg group， EC 800 mg/kg group， positive control group （N-ethyl-N-nitrosourea 40 mg/kg）. Those rats were given relevant medicine intragasttrically for 4 d； clinical symptoms of rats were observed and body weight was recorded during experiment. Within 3 h after last medication， the rats were sacrificed； liver， renal and lung weight were weighed； liver， kidney， lung and peripheral blood lymphocytes were collected. The single cell suspension was prepared to perform alkaline comet assay. After lysis， unwind， electrophoresis and dying， tail DNA% and tail distance of samples were analyzed by Komet 6.0 software. RESULTS： Compared with negative control group， body weight， liver and renal weight of rats were decreased significantly in PCZ 75 mg/kg group， PCZ 150 mg/kg group and positive control group 4 d after medication （P<0.05 or P<0.01）. Body weight of rats were decreased significantly in EC 800 mg/kg 4 d after medication （P<0.05 or P<0.01）； there was no statistical significance （P>0.05）. Compared with negative control group， tail DNA% and tail distance in liver， kidney and peripheral blood lymphocytes were increased significantly in PCZ 75 mg/kg group， PCZ 150 mg/kg group and positive control group （P<0.05 or P<0.01）； PCZ showed more significant effects on liver and lung. Tail DNA% and tail distance of liver， kidney and peripheral blood lymphocytes were increased significantly in EC 800 mg/kg group （P<0.05 or P<0.01）， and tail DNA% and tail distance of renal tissue was increased significantly in EC 400 mg/kg group （P<0.05）. CONCLUSIONS： PCZ induced stronger DNA damage； liver and lung are the major genotoxicity target of PCZ. EC-induced DNA damage is relatively weak， and kidney is the most sensitive organ for EC-induced genotoxicity.

KEYWORDS Alkaline comet assay； in vivo genotoxicity； Procarbazine hydrochloride； Ethyl carbamate； SD rats

彗星實驗（Comet assay），又稱單細胞凝膠電泳實驗（Single cell gel electrophoresis，SCGE），是在個體細胞水平上檢測DNA單鏈或雙鏈斷裂的實驗方法。該方法最初由Ostling和Johansson于1984年建立，之后經Singh等在1988年改進[1]。因損傷的DNA與完整的DNA電泳時的遷移速率不同，損傷的DNA經電泳后可形成“彗星”樣結構，故可通過凝膠電泳來區分是否存在DNA鏈斷裂，彗星實驗也因此得名。堿性電泳液（pH>13.0）條件下開展的彗星實驗同時兼顧了DNA單鏈和雙鏈斷裂及堿性不穩定點（當檢測樣本中存在脫嘌呤或脫嘧啶位點時，可在強堿條件下轉換為DNA斷裂）的檢測[2]。彗星實驗不依賴于特殊細胞表型或動物模型，可利用外周血、肝、腎、肺、胃黏膜、膀胱、精子等多種組織開展，因此可針對藥物蓄積部位及靶器官研究受試物對DNA斷裂的影響[3]。由于DNA斷裂多在給藥后短期內出現，且DNA單鏈斷裂是可修復的，因此在末次給藥和損傷評估之間的檢測窗較短，但對短時間內誘發的DNA損傷也較為敏感。體內彗星實驗的主要優勢是可以較為靈敏地預測藥物的體內遺傳毒性作用靶器官，彌補常規遺傳毒性組合實驗中實驗體系的局限性。

本研究使用的鹽酸丙卡巴肼（Procarbazine hydrochloride，PCZ）屬于肼類衍生物，經體內代謝活化后生成能夠與DNA反應的烷基化活性基團（甲基重氮離子），從而促進誘導DNA加合物O-6-甲基鳥嘌呤（O-6-meG）生成，在臨床上用于霍奇金淋巴瘤和神經膠質瘤等的治療[4]；烏拉坦（Ethyl carbamate，EC），又稱尿烷（Urethane），在體內可誘導DNA加合物7-（2-氧乙基）鳥嘌呤的生成，曾用于鎮靜、催眠和慢性白血病及多發性骨髓瘤的治療[5]。有研究顯示，PCZ和EC均存在一定的臟器毒性[4-6]，并需通過體內細胞色素酶P450（CYP）2E1和羧酸酯同工水解酶A代謝促進DNA加合物的生成來產生遺傳毒性效應[7]。本研究采用體內堿性彗星實驗，針對肝、腎、肺和外周血淋巴細胞，對PCZ和EC可能產生的體內DNA致斷裂作用及其靶器官進行評價。

1 材料

1.1 儀器

NTS-1300恒溫振蕩水槽（東京理化器械株式會社）；DYCP-31F電泳儀和DYY-6C電泳儀電源（北京市六一儀器廠）；Nikon eclipse 80i熒光顯微鏡（日本尼康公司）；Komet 6.0圖像分析系統（英國安道爾科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

PCZ原料藥（大連美侖生物技術有限公司，批號：J0506A，純度：≥98%）；EC對照品（批號：BCBP1319V，純度：≥99%）、N-乙基-N-亞硝基脲（ENU，批號：SLBF6373V，純度：≥99%）和乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na，批號：SLBK2568V，純度：≥99.0%）均購自美國Sigma-Aldrich公司；超純水[ddH2O，自制，以MilliQ-A10超純水機生產（121℃、15 min高壓滅菌，4 ℃冰箱保存]；Trevigen Comet Assay? Kit 彗星檢測試劑盒（美國Trevigen公司，批號：4250-050-K）；HBSS-Hanks平衡鹽溶液 （無鈣、鎂離子）和磷酸鹽緩沖液（PBS，無鈣、鎂離子）購自美國Cellgro公司；SYBR綠色Ⅰ核苷酸膠體染料[美國Invitrogen公司，使用時按1 ∶ 10 000溶解于二甲基亞砜（DMSO）中]。

1.3 動物

SPF級Sprague Dawley（SD）大鼠30只，♂，給藥時6～7周齡，體質量190～230 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（京）2016-0011。大鼠在恒溫（20～26℃）、恒濕（40%～70%）條件下明暗周期12 h/12 h飼養，飼養密度為每籠2～3只，全價顆粒飼料喂養，自由攝食和飲水。本研究方案通過國家藥物安全評價監測中心實驗動物福利倫理委員會的倫理審查。

2 方法

2.1 分組與給藥

取檢疫期結束后大鼠30只，采用TOXSTAT 2006數據統計分析軟件，根據體質量按分層隨機化法分為陰性對照組（超純水）、PCZ 75 mg/kg組、PCZ 150 mg/kg組、EC 400 mg/kg組、EC 800 mg/kg組以及陽性對照組（ENU，40 mg/kg），每組5只，分組時大鼠個體體質量差異不得大于平均體質量的±20%。PCZ和EC的給藥劑量根據前期劑量范圍探索預實驗結果確定，其中最大劑量為大鼠連續3 d給藥的最大耐受劑量，且符合《OECD嚙齒動物28天重復劑量經口毒性研究》[8]對重復給藥毒性實驗最大耐受劑量的要求。另外，ENU作為遺傳毒性陽性對照品，3 d給藥研究的最大耐受劑量為40 mg/kg[9]，即為本實驗的給藥劑量。各組大鼠給藥前未禁食過夜，每天灌胃給藥1次，給藥體積為10 mL/kg，連續給藥4 d，兩次給藥間隔均為24 h。

2.2 臨床癥狀與體質量

給藥期間每天上午和下午隔籠觀察所有大鼠活動狀態、瀕死情況、存活情況、外觀及毛色、有無外傷、糞便情況等。首次給藥前及給藥4 d后稱大鼠體質量。

2.3 臟器處理

所有大鼠于首次給藥后72～75 h腹腔注射4.5%戊巴比妥鈉（麻醉劑量為45 mg/kg），麻醉后從腹腔后大靜脈進行采血50 μL，放入肝素化采血管，反復振搖防止凝血，放冰盒內備用；完全放血處死后，剝離肝、腎（雙側）、肺，迅速稱質量。留取大鼠肝左葉中間部分約10 mm3組織，備用；單側腎，棄去包膜，沿皮質大彎中心處取約10 mm3組織，備用；右肺上葉部分取約10 mm3組織，備用。

2.4 堿性彗星實驗

將肝、腎、肺組織放入預冷的切碎液中反復刷洗后放入5 mL離心管內，加入3 mL預冷的切碎液，用剪刀剪碎組織（約100次）以釋放細胞，制成單細胞懸液，然后輕輕吹打約15次后，放冰盒內備用。肝、腎、肺的單細胞懸液，用含20 mmol/L EDTA-2Na的HBSS溶液（pH 7.5）調整密度至2×105個/mL左右，再與凝膠以1 ∶ 10比例混合后鋪片。另取大鼠采血管中外周血，直接與凝膠以1 ∶ 15比例混合后鋪片。經制片、裂解、解旋、電泳、中和、脫水等步驟后分別制成肝、腎、肺、外周血的單細胞凝膠標本[9]。所有標本使用SYBR綠Ⅰ核苷酸膠體染料（1 ∶ 10 000）染色，并在放大倍數為200～400倍的熒光顯微鏡下拍照。使用Komet 6.0彗星圖像分析軟件進行分析，每只大鼠至少分析100個細胞中“刺猬細胞”的數量及100個彗星細胞的細胞核彗星拖尾情況。計算每組大鼠平均“刺猬細胞”數、尾DNA百分含量（尾DNA%）和尾距的中位數平均值。

2.5 數據處理

數據圖和統計結果采用GraphPad Prism 7軟件進行處理。各組大鼠體質量、臟器質量、血清生化指標、彗星實驗結果均以x±s的形式列出。其中體質量、臟器質量和彗星實驗結果采用單因素方差分析對組間數據進行檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 臨床癥狀與體質量變化

實驗期間，各組大鼠臨床癥狀均未見明顯異常。與陰性對照組比較，PCZ 75、150 mg/kg組大鼠給藥4 d后體質量明顯降低（P<0.01），自身體質量變化幅度約分別為-0.4%、-5.8%；EC 800 mg/kg組和陽性對照組大鼠給藥4 d后體質量也明顯降低（P<0.05），EC 800 mg/kg組大鼠自身體質量變化幅度約為-1.1%。各組大鼠的體質量變化見表1。

3.2 臟器質量變化

與陰性對照組比較，PCZ 75、150 mg/kg組大鼠給藥4 d后的肝、腎質量均明顯降低（P<0.05或P<0.01）；陽性對照組大鼠給藥4 d后的肝質量明顯降低（P<0.05），其他差異均無統計學意義（P>0.05）。各組大鼠的肝、腎、肺質量變化見表2。

3.3 彗星實驗結果

彗星實驗可以較為敏感地捕捉到受試物對細胞DNA的損傷作用，因此在體內遺傳毒性研究中可在早期有效檢出較弱的遺傳毒性化合物，并有助于對腫瘤靶向臟器進行預測。與陰性對照組比較，PCZ 75、150 mg/kg組和陽性對照組大鼠肝、腎、肺和外周血淋巴細胞的尾DNA%和尾距均明顯增加（P<0.05或P<0.01），其中PCZ對肝、肺的影響程度更明顯；EC 800 mg/kg組大鼠肝、腎和外周血淋巴細胞的尾DNA%和尾距均明顯增加（P<0.05或P<0.01），EC 400 mg/kg組大鼠僅腎細胞的尾DNA%和尾距明顯增加（P<0.05）。各組大鼠不同組織的彗星試驗結果見表3，彗星試驗圖見圖1（低劑量組圖略）。

本研究結果顯示，連續灌胃給藥4 d，PCZ 75或150 mg/kg均可導致其肝細胞、腎細胞、肺細胞和外周血淋巴細胞的細胞核完整性受到嚴重破壞。而EC誘導的細胞DNA損傷相對較弱，腎是其遺傳毒性作用最敏感的器官。

4 討論

本研究對SD大鼠連續4 d灌胃PCZ或EC，雖然臨床癥狀無明異常，但兩者對大鼠體質量增長均有一定的抑制作用，其中灌胃PCZ的大鼠肝、腎質量也明顯降低。在本實驗給藥劑量下，PCZ和EC對SD大鼠均有一定的毒性，且PCZ的毒性更為嚴重。實驗結果與臨床報道的副作用基本一致[3，10]。

PCZ和EC均曾經作為抗腫瘤藥物應用于臨床[11-12]，但因其體內致癌風險如今已較少使用。如，PCZ可誘導急性繼發性非淋巴細胞白血病[11]，EC可誘導肺癌和肝癌的形成[6，13]。PCZ和EC均需經體內代謝后生成可與DNA反應的活性基團后，才可通過干擾遺傳物質的合成來發揮致癌潛能[4，7]。盡管兩者在體外遺傳毒性研究中多表現為陰性結果[14-15]，但包括本課題組在內的大量體內研究均提示兩者的遺傳毒性實驗（包括Pig-a基因突變實驗、外周血微核實驗、骨髓微核實驗等）結果呈陽性[16-18]，有必要對該類化合物進行體內遺傳毒性研究。

有研究報道，重復靜脈給予PCZ可誘導以LacZ基因為報告基因的Muta小鼠肺、脾、肝和骨髓產生組織特異性致突變和致斷裂性效應[19]。體內彗星實驗有助于對藥物體內遺傳毒性易感組織進行判斷，本研究使用PCZ與EC來驗證該方法用于評價組織靶向性時的可靠性。結果發現，PCZ可誘導大鼠肝、腎、肺和外周血淋巴細胞的細胞DNA結構發生嚴重損傷，PCZ 75 mg/kg組大鼠的尾DNA%約為陰性對照組的4～5倍，PCZ 150 mg/kg組大鼠的尾DNA%約為陰性對照組的6～9倍，其中肝和肺的受損程度較為突出，可以推測肝和肺是PCZ遺傳毒性作用的易感器官。相比之下，EC則屬于弱遺傳毒性化合物。Stankowshi LF等[20]研究發現，EC在SD大鼠重復給藥15 d和28 d后可分別誘導外周血淋巴細胞及肝細胞彗星實驗出現陽性結果。轉基因小鼠致癌研究結果提示，EC可誘導肺細胞、肝細胞、骨髓細胞和脾臟細胞突變率顯著升高約2倍，以及骨髓細胞微核率升高約8倍[21]。美國環保署（EPA）和世界衛生組織國際癌癥研究機構（IARC）也指出腎損傷和肝損傷是人類短期暴露于EC的主要風險[22]。本研究結果顯示，連續4 d灌胃SD大鼠400 mg/kg的EC可誘導其腎細胞出現DNA損傷；在800 mg/kg劑量下，肝、腎和外周血淋巴細胞均出現一定的DNA損傷，但受損程度明顯低于PCZ 150 mg/kg劑量組。此外，400、800 mg/kg的EC均未能誘導SD大鼠肺細胞核結構出現嚴重拖尾，提示在當前研究體系中，腎對EC體內代謝產物遺傳毒性最敏感，肺則最不敏感。綜上，本研究開展彗星實驗對PCZ和EC的體內遺傳毒性強弱和遺傳毒性靶器官進行驗證，結果與文獻報道[19-22]基本相符。

體內彗星實驗可較為靈敏地分析受試物的遺傳毒性靶器官，尤其是以染色體損傷為檢測終點的體內微核實驗無法檢出的那些較為細小的DNA損傷。2011年人用藥物注冊技術要求國際協調會（ICH）在藥物遺傳毒性研究技術指導原則修訂草案ICH S2（R1）中建議除骨髓微核實驗之外，增加肝細胞彗星實驗作為第二個體內遺傳毒性檢測終點[23]。世界經濟合作與發展組織（OECD）已于2014年頒布體內堿性彗星實驗指導原則[24]，在我國于2018年新頒布的《藥物遺傳毒性研究技術指導原則》[25]中也列入了該方法。當前國際上已完成肝細胞彗星實驗實驗室間聯合驗證工作[26]，我國已于2015年開展了體內彗星實驗實驗室間聯合驗證工作，驗證結果將有助于體內彗星實驗方法在國內安全評價領域的標準化及推廣。本課題組通過使用PCZ和EC兩種遺傳毒性強弱不同的受試物對體內多臟器堿性彗星實驗的可行性進行了驗證，為該方法在國內的實施提供了數據支持。

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（收稿日期：2018-07-02 修回日期：2018-11-13）

（編輯：鄒麗娟）