欖錢含片對東莨菪堿致小鼠學習記憶障礙的改善作用研究

姜舒 易湘茜 沈關媛 李瓊 杜正彩 高程海

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）01-0036-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.01.08

摘 要 目的：研究欖錢含片對東莨菪堿致小鼠學習記憶障礙的改善作用。方法：將小鼠隨機分為空白組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、陽性組（鹽酸多奈哌齊片，1.52 mg/kg）和欖錢含片高、中、低劑量組（800、400、200 mg/kg），每組14只。每天1次，連續灌胃給藥30 d后，除空白組外，其余各組小鼠腹腔注射氫溴酸東莨菪堿3 mg/kg制備記憶障礙模型。造模后，采用避暗實驗（觀察指標為潛伏期、進入暗室錯誤次數）和Morris水迷宮實驗（觀察指標為登臺時間、穿臺次數、目標象限游泳時間）評價各組小鼠學習記憶能力的變化，然后檢測各組小鼠腦組織中乙酰膽堿（Ach）、乙酰膽堿轉移酶（ChAT）、乙酰膽堿酯酶（AchE）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的水平。結果：與空白組比較，模型組小鼠潛伏期、穿臺次數、目標象限游泳時間及ChAT、Ach、SOD水平顯著縮短或降低（P<0.05或P<0.01），進入暗室錯誤次數、登臺時間及AchE、MDA水平顯著延長或升高（P<0.01）；與模型組比較，陽性組和欖錢含片各劑量組小鼠潛伏期（除欖錢含片低劑量組）、穿臺次數、目標象限游泳時間及ChAT、Ach、SOD水平顯著延長或升高（P<0.05或P<0.01），進入暗室錯誤次數（除欖錢含片低劑量組）、登臺時間（除欖錢含片低劑量組）及AchE、MDA（除欖錢含片中、低劑量組）水平顯著縮短或降低（P<0.05或P<0.01）。結論：欖錢含片可能通過增加ChAT、Ach、SOD水平及降低AchE、MDA水平改善東莨菪堿致小鼠學習記憶障礙。

關鍵詞 欖錢含片；東莨菪堿；學習記憶障礙；小鼠；改善作用

Study on the Improvement Effects of Lanqian Buccal Tablet on Scopolamine-induced Learning and Memory Impairment of Mice

JIANG Shu，YI Xiangxi，SHEN Guanyuan，LI Qiong，DU Zhengcai，GAO Chenghai（School of Pharmacy/Institute of Marine Drugs， Guangxi University of TCM， Nanning 530200， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the improvement effects of Lanqian buccal tablets on scopolamine-induced learning and memory impairment of mice. METHODS： The mice were randomly divided into blank group （normal saline）， model group （normal saline）， positive group （Donepezil hydrochloride tablets， 1.52 mg/kg） and Lanqian buccal tablets high-dose， medium-dose and low-dose groups （800， 400， 200 mg/kg）， with 14 mice in each group. Once a day， 30 days after continuous intragastric administration， except for blank group， other groups were intraperitioneal injected scopolamine hydrobromide 3 mg/kg to induce learning and memory impairment model. After modeling， the learning and memory ability of mice were evaluated with step through test （latency， mistake times of entering darkroom as indexes） and Morris water maze （the time of going up on the platform， the times of crossing the platform， swimming time in target quadrant as indexes）. The levels of Ach， ChAT， AchE， SOD and MDA in cerebral tissue of mice were determined. RESULTS： Compared with blank group， latency， the times of crossing the platform， swimming time in target quadrant， the levels of ChAT， Ach and SOD were shortened or decreased significantly in model group （P<0.05 or P<0.01）， while mistake times of entering darkroom， the time of going up on the platform， the levels of AchE and MDA were extended or rised significantly （P<0.01）. Compared with model group， latency （except for Lanqian buccal tablet low-dose group）， the times of crossing the platform， swimming time in target quadrant， the levels of ChAT， Ach and SOD were extended or rised significantly in positive group and Lanqian buccal tablet groups （P<0.05 or P<0.01）. The mistake times of entering darkroom （except for Lanqian buccal tablet low-dose group）， the time of going up on the platform （except for Lanqian buccal tablet low-dose group） and the levels of AchE and MDA （except for Lanqian buccal tablet medium-dose and low-dose group） were shortened or decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Lanqian buccal tablet can improve scopolamine-induced learning and memory impairment of mice by increasing the levels of ChAT， Ach and SOD and decreasing the levels of AchE and MDA.

KEYWORDS Lanqian buccal tablets； Scopolamine； Learning and memory impairment； Mice； Improvement effect

白骨壤（Avicennia marina）是馬鞭草科海欖雌屬植物，是世界上分布最廣的一種紅樹林植物[1]，其果實俗稱欖錢。欖錢味甘、微苦，性涼，具有清熱、利尿、涼血敗火的功效，是藥食兩用的佳品[2]。本課題組前期研究發現，欖錢不僅含有芳香酯和酚苷類化合物，還富含苯乙醇苷類化合物[2-7]。相關研究表明，苯乙醇苷具有顯著的神經保護作用，能改善氧化應激后的記憶障礙[8-10]。阿爾茨海默病（AD）是老年人群中發病率和病死率較高的疾病之一[11]。目前，常采用東莨菪堿誘導失憶動物模型進行AD認知損傷的潛在作用機制研究[12]。乙酰膽堿（Ach）是腦內促進學習記憶的重要神經遞質之一，在腦內由乙酰膽堿轉移酶（ChAT）催化合成，通過乙酰膽堿酯酶（AchE）分解，形成Ach的代謝循環，當ChAT活性下降或 AchE 活性增強時均會影響腦內Ach的水平[13]。超氧化物歧化酶（SOD）是機體內源性抗氧化酶，其活性降低可提示腦部氧化應激損傷，丙二醛（MDA）是一種重要的脂質過氧化產物，其水平異常增加也與記憶損傷有關[14]。現階段治療AD的主要用藥為鹽酸多奈哌齊，其作用機制是可逆性地抑制AchE引起的Ach水解，從而增加Ach含量[15]。目前，市面上還沒有以欖錢為主要原料的輔助改善記憶的產品，因此，筆者以欖錢60%乙醇洗脫后濃縮成的浸膏制成的AD含片，通過避暗實驗和Morris水迷宮實驗觀察其對東莨菪堿致小鼠學習記憶障礙的改善作用及對小鼠腦組織中膽堿能系統指標Ach、ChAT、AchE和抗氧化系統指標SOD、MDA活性的影響，為欖錢改善小鼠學習記憶障礙的機制研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BP211D萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）；YKKYFM40制冰機（北京長流科學儀器公司）；PGL-16冷凍離心機（湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司）；Bio-Tek全波長酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；BW-MWM101大小鼠通用Morris水迷宮、BW-MPA105避暗儀均購自上海軟隆科技發展有限公司。

1.2 藥品與試劑

欖錢藥材于2015年8月采自廣西北海合浦白沙鎮，由廣西科學院廣西北部灣海洋研究中心許銘本工程師鑒定為真品；氫溴酸東莨菪堿注射劑（阿達瑪斯試劑有限公司，批號：P1175427，純度：>99%，規格：1 mL ∶ 0.3 mg）；鹽酸多奈哌齊片（陜西方舟制藥有限公司，批號：170701，規格：5 mg/片）；SOD、MDA、ChAT、AchE、Ach試劑盒（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號：MU30590、MU30447、MU3091、MU30435、MU30372）。

1.3 動物

SPF級小鼠84只，♂，體質量（25±2） g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK- （湘）2016-0002。小鼠飼養溫度為25～26 ℃，期間自由進食進水。

2 方法

2.1 欖錢含片的制備

參考文獻[16]方法，以60%乙醇洗脫部位為有效成分，得到欖錢浸膏（苯乙醇苷的含量為38.22%）；然后以浸膏作為主藥，與預膠化淀粉等輔料混合制軟材，再經干燥、整粒、壓片等工藝得規格為0.5 g/片的欖錢含片（每片中苯乙醇苷的含量為25%）。

2.2 分組、給藥與造模

將84只小鼠隨機分為空白組、模型組、陽性組（鹽酸多奈哌齊片，1.52 mg/kg，根據成人臨床用量換算而得）和欖錢含片高、中、低劑量組（800、400、200 mg/kg，參考文獻[17]確定給藥劑量），每組14只。空白組和模型組給予等量的生理鹽水。每天1次，連續灌胃給藥30 d后，參考文獻[12]方法，除空白組外，其余各組小鼠分別腹腔注射氫溴酸東莨菪堿3 mg/kg制備學習記憶障礙模型，空白組腹腔注射同體積生理鹽水。

2.3 避暗實驗

先將各組小鼠放入避暗箱的明室中，不通電，自由活動3 min；再將小鼠趕入暗室，通電（50 V，0.6 mA，下同）刺激小鼠進入明室，每只小鼠訓練5 min；間隔24 h后將小鼠放入明室并通電，同時啟動計時器，小鼠首次到達暗室的時間即為潛伏期；進入暗室的次數即錯誤次數。記錄每只小鼠潛伏期和2 min內小鼠進入暗室的錯誤次數。

2.5 Morris水迷宮實驗

參考文獻[18]方法，將水池分為4個虛擬象限，并在目標象限（第4象限）的中心放置圓形黑色平臺，實驗期間其位置保持不變，水迷宮上方安裝攝像機，記錄小鼠運動軌跡。實驗前5 d進行定位航行訓練，將小鼠放至平臺適應環境20 s后放入水中，小鼠找到平臺的時間即為登臺時間。第6 d去掉平臺，記錄各小鼠90 s內經過平臺的穿臺次數和目標象限游泳時間。

2.6 腦組織中相關指標檢測

行為學實驗結束后，各組小鼠禁水禁食，然后腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）進行麻醉，取腦并稱質量，放置于勻漿器中，加入9倍量生理鹽水，勻漿；4 ℃下 3 000 r/min離心15 min，然后取上清液按照相關試劑盒說明書的方法步驟檢測膽堿能系統指標Ach、ChAT、AchE和抗氧化系統指標SOD、MDA的水平。

2.7 統計學方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行分析，計量資料均以x±s表示，采用單因素方差分析，組間差異比較采用LSD法。P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 避暗實驗結果

與空白組比較，模型組小鼠進入暗室錯誤次數顯著增加（P<0.05），潛伏期顯著縮短（P<0.01）；與模型組比較，陽性組和欖錢含片高、中劑量組小鼠進入暗室錯誤次數顯著減少（P<0.05），潛伏期顯著延長（P<0.01），欖錢含片低劑量組小鼠進入暗室錯誤次數、潛伏期無顯著性差異（P>0.05）。各組小鼠避暗實驗結果見表1。

3.4 腦組織中SOD、MDA水平檢測結果

與空白組比較，模型組小鼠腦組織中SOD水平顯著降低（P<0.01），MDA水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，陽性組和欖錢含片高、中、低劑量組小鼠腦組織中SOD水平顯著升高（P<0.05或P<0.01），陽性組和欖錢含片高劑量組小鼠腦組織中MDA水平顯著降低（P<0.05）。各組小鼠腦組織中SOD、MDA水平檢測結果見表4。

4 討論

Morris水迷宮實驗和避暗實驗為經典的行為學檢測方法，Morris水迷宮實驗是一種對嚙齒類動物進行空間學習能力的測試方法，經常被用于神經認知障礙的嚙齒動物模型的驗證和神經認知治療的評估；避暗實驗是利用小鼠具有趨暗避明的習性而設計的一種實驗方法[18]。本研究結果顯示，避暗實驗中模型組小鼠進入暗室錯誤次數明顯增加且潛伏期明顯縮短；Morris水迷宮實驗中模型組登臺時間明顯延長，穿臺次數和目標象限游泳時間明顯降低；灌胃欖錢含片后能顯著增加小鼠的穿臺次數和目標象限游泳時間，并縮短潛伏期，進一步提示欖錢含片可以改善東莨菪堿致小鼠的學習記憶障礙。

膽堿能系統破壞被認為是癡呆發生的重要因素，膽堿能神經元的退化會損害記憶[19]，Ach可以促進腦部結構損傷后情景記憶功能的恢復，且Ach受體是影響神經免疫系統功能的關鍵物質[20]。本實驗結果表明，欖錢含片可能通過增加Ach、ChAT水平和降低AchE水平來改善東莨菪堿所致小鼠學習記憶障礙。

氧化應激是AD發展的一個重要因素，由生物系統中活性氧（ROS）產生和消除之間的不平衡引起；過量生產ROS會加速生物大分子的分解，從而使機體受到氧化損傷；因此，為了保護細胞抗ROS引起的氧化損傷，機體內的內源性抗氧化酶（例如SOD）被激活[21]。據有關文獻報道，由于氧化應激和認知功能障礙之間存在很強的相關性，調節ROS的藥物在提高學習能力和改善記憶缺陷方面具有顯著的作用[22]。本研究的結果表明，欖錢含片可降低模型小鼠腦組織中SOD的水平，提示欖錢含片能從氧化應激的角度改善AD。

綜上所述，欖錢含片可以改善東莨菪堿致小鼠的學習記憶障礙，其作用機制可能與增加ChAT、Ach、SOD水平及降低AchE、MDA水平有關。

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（收稿日期：2018-08-13 修回日期：2018-10-24）

（編輯：唐曉蓮）