桄榔子醇提物對小鼠/大鼠的鎮痛、抗炎作用

李鳳金 王博 霍金海 黃璐琦 王偉明

中圖分類號 R284.2；R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）01-0059-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.01.13

摘 要 目的：探討桄榔子醇提物灌胃給藥后對小鼠/大鼠的鎮痛、抗炎作用。方法：取小鼠隨機分為桄榔子醇提物組和溶劑對照組（蒸餾水），每組20只，采用最大給藥量法，觀察桄榔子醇提物的灌胃急性毒性。取小鼠隨機分為桄榔子醇提物高、中、低劑量組[小鼠劑量為6.5、3.25、1.625 g/kg（以醇提物計，下同），灌胃]和陽性對照組（嗎啡0.005 g/kg，腹腔注射）、空白對照組（蒸餾水，灌胃），通過熱板法評價其鎮痛作用，比較給藥后30、60、90 min的舔爪潛伏期；取小鼠隨機分為桄榔子醇提物高、中、低劑量組（小鼠劑量為6.5、3.25、1.625 g/kg，灌胃）和陽性對照組（洛索洛芬鈉0.023 g/kg，灌胃）、模型對照組（蒸餾水，灌胃），通過醋酸扭體法評價其鎮痛作用，比較20 min內的扭體次數，計算扭體抑制率；取小鼠隨機分為桄榔子醇提物高、中、低劑量組（小鼠劑量為6.5、3.25、1.625 g/kg，灌胃）和陽性對照組（嗎啡0.005 g/kg，腹腔注射）、模型對照組（蒸餾水，灌胃），通過福爾馬林致痛法評價其鎮痛作用，比較福爾馬林給藥后0～5 min和10～40 min的舔爪總時間，計算舔爪抑制率；取小鼠按醋酸扭體法實驗分組，每天給藥1次，連續給藥3 d，采用二甲苯致炎，比較耳腫脹度。取大鼠隨機分為桄榔子醇提物高、中、低劑量組（4.5、2.25、1.125 g/kg，灌胃）和陽性對照組（洛索洛芬鈉0.016 g/kg，灌胃）、模型對照組（蒸餾水，灌胃）、空白對照組（蒸餾水，灌胃），每天給藥1次，連續給藥3 d，采用弗式完全佐劑致炎，再連續給藥7 d，比較致炎前和致炎后7 d內的足腫脹度。上述各鎮痛和抗炎實驗每組動物數為8～14只。結果：與溶劑對照組比較，桄榔子醇提物組小鼠體質量增長趨勢無明顯變化，未發現與給藥相關的毒性反應出現。與空白對照組比較，桄榔子醇提物高劑量組小鼠給藥后30、60 min的舔爪潛伏期明顯延長（P<0.01）；與模型對照組比較，桄榔子醇提物高、中、低劑量組小鼠扭體次數明顯降低（P<0.01），舔爪總時間明顯縮短（P<0.05或P<0.01），耳腫脹度明顯降低（P<0.01）。與模型對照組比較，桄榔子醇提物高劑量組大鼠致炎后4 h開始足腫脹度明顯降低（P<0.01），作用持續至第7天。結論：桄榔子醇提物對小鼠/大鼠無明顯的口服急性毒性并有明顯的鎮痛和抗炎作用。

關鍵詞 桄榔子醇提物；鎮痛；抗炎；耳腫脹；足腫脹；小鼠；大鼠

Analgesic and Anti-inflammatory Effects of Ethanol Extract from Arenga pinnata in Mice/Rats

LI Fengjin1，WANG Bo1，HUO Jinghai1，HUANG Luqi2，WANG Weiming1（1.Chinese Materia Medica Institute， Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine， Harbin 150036， China；2.Center for Chinese Materia Medica Resource， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the analgesic and anti-inflammatory effects of ethanol extract from Arenga pinnata in mice/rats after intragastric administration. METHODS： The mice were randomly divided into A. pinnata ethanol extract group and solvent control group （distilled water）， with 20 mice in each group. Maximal dosage method was used to observe the acute toxicity of ethanol extract from A. pinnata with intragastric administration. The mice were randomly divided into A. pinnata ethanol extract high-dose， medium-dose and low-dose groups [6.5， 3.25， 1.625 g/kg （by ethanol extract， similarly here in after）， i.g.]， positive control group （0.005 g/kg morphine， i.p.） and blank control group （distilled water， i.g.）. The analgesic effect was evaluated by hot plate method， and the licking latency was compared 30， 60 and 90 minutes after administration. The mice were randomly divided into A. pinnata ethanol extract high-dose， medium-dose and low-dose groups （6.5， 3.25， 1.625 g/kg， i.g.）， positive control group （loxoprofen sodium 0.023 g/kg， i.g.） and model control group （distilled water， i.g.）. The analgesic effect was evaluated by acetic acid writhing method. The writhing times within 20 minutes were compared and the writhing inhibition rate was calculated. The mice were randomly divided into A. pinnata ethanol extract high-dose， medium-dose and low-dose groups （6.5， 3.25， 1.625 g/kg， i.g.）， positive control group （morphine 0.005 g/kg， i.p.）， model control group （distilled water， i.g.）. The analgesic effect was evaluated by formalin-induced pain method. The total licking time was compared between 0-5 min and 10-40 min after formalin administration； the inhibition rate of licking was calculated. The mice were grouped according to acetic acid writhing test. The mice were given relevant medicine once a day for consecutive 3 days. The mice were given xylene to induce inflammation model， and the degree of ear swelling was compared. Rats were randomly divided into A. pinnata ethanol extract high-dose， medium-dose and low-dose groups （4.5， 2.25， 1.125 g/kg， i.g.）， positive control group （losoprofen sodium 0.016 g/kg， i.g.）， model control group （distilled water， i.g.） and blank control group （distilled water， i.g.）， once a day， for consecutive 3 days. The rats were given Freund’s complete adjuvant to induce inflammation model and then given relevant medicine for consecutive 7 d. The degree of paw swelling was compared before inflammation and within 7 days after inflammation. The number of mice/rats in each group was 8 to 14 in the analgesic and anti-inflammatory tests. RESULTS： Compared with solvent control group， the body weight of mice had no significant increase in A. pinnata ethanol extract group； no drug-induced toxicity was found. Compared with blank control group， licking latency in mice was significantly prolonged in A. pinnata ethanol extract high-dose group 30 and 60 minutes after medication （P<0.01）. Compared with model control group， the times of writhing， total licking time and the degree of ear swelling of mice were decreased significantly in A. pinnata ethanol extract high-dose， medium-dose and low-dose groups （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model control group， the degree of paw swelling began decrease significantly in A. pinnata ethanol extract high-dose group 4 h after inducing inflammation， and the effect lacted until the 7th day （P<0.01）. CONCLUSIONS： A. pinnata ethanol extract has no significant acute oral toxicity， and possesses significant analgesic and anti-inflammatory effects.

KEYWORDS Arenga pinnata ethanol extract； Analgesic； Anti-inflammatory； Ear edema； Paw swelling； Mice； Rat

桄榔[Arenga pinnata （Wurmb.） Merr.]是棕櫚科桄榔屬植物，又名山椰子、南椰、砂糖椰子等，為多年生常綠喬木，生長在溫濕地區的山林中。到目前為止，全世界共發現桄榔屬植物24種，其中6種主要分布在我國廣東、廣西、云南、福建、海南和臺灣等地區[1]。桄榔是我國傳統的藥用植物，干燥髓部經研磨成粉為桄榔面，其味甘，性平，具有補虛的功效[2]；桄榔子是桄榔的成熟干燥果實，味苦、性平、無毒，具有活血止痛、消食化積的功效[3]。本課題組前期研究發現，桄榔子醇提物對酵母多糖誘導的小鼠急性腹膜炎具有明顯的改善作用。但是，桄榔子醇提物鎮痛、抗炎作用的實驗研究尚未見國內外文獻報道。因此，本研究采用熱刺激法、化學刺激法等疼痛模型探討桄榔子醇提物的鎮痛作用，應用急性和慢性炎癥等炎癥模型探討其抗炎作用，為其臨床應用及進一步開發利用提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

RB-200智能熱板儀和PV-200足趾容積測量儀（成都太盟軟件有限公司）；雙PXS-1040VI目體視顯微鏡（上海光學儀器一廠）。

1.2 藥品與試劑

桄榔子醇提物，由黑龍江省中醫藥科學院中藥研究所提供；桄榔子新鮮果實產地為廣西北海市，于2017年7月采摘，經黑龍江省中醫藥科學院王偉明教授鑒定為棕櫚科植物桄榔[Arenga pinnata （Wurmb.） Merr.]的果實；洛索洛芬鈉片（第一三共制藥上海有限公司，批號：SS032LA，規格：60 mg/片）；鹽酸嗎啡注射液（東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，批號：130900，規格：1 mL ∶ 10 mg）；弗式完全佐劑（美國Sigma公司，貨號：F5881）；生理鹽水（哈爾濱三聯藥業股份有限公司，批號：161104D12）；乙酸（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20120808，分析純）；甲醛和二甲苯（天津市天力化學試劑有限公司，批號：20160001、20180203，分析純）。

1.3 動物

SPF級ICR小鼠，♂♀兼用，體質量18～24 g；SD大鼠，♂，體質量200～240 g，均由哈爾濱醫科大學實驗動物中心提供，大鼠和小鼠的生產許可證號均為SCXK（黑）2013-001。

2 方法

2.1 桄榔子醇提物的制備

取桄榔子新鮮果實17.5 kg，粉碎后，加2倍量的95%乙醇浸泡24 h，10倍量的95 %乙醇滲漉，收集滲漉液，60 ℃減壓回收乙醇，得提取物800 g，其中白屈菜酸鹽含量在10%～12%之間。

2.2 桄榔子醇提物的急性毒性實驗

采用最大給藥量法[4]進行小鼠急性毒性實驗。取40只小鼠，♂♀各半，按性別和體質量，采用隨機區組設計法將小鼠隨機分為桄榔子醇提物組和溶劑對照組，每組20只。桄榔子醇提物最大灌胃給藥濃度為0.65 g/mL，給藥體積為40 mL/kg，即給藥劑量為26 g/kg。溶劑對照組小鼠灌胃等體積蒸餾水。同一天給藥2次，2次間隔6 h。記錄給藥前（0 d）和實驗結束后（14 d）各組小鼠體質量變化情況，觀察14 d內各組小鼠是否出現中毒癥狀，如大、小便及其顏色變化，眼、鼻、口腔有無異常分泌物，呼吸、被毛、行為活動、精神狀態和存活情況等，如出現中毒癥狀，記錄出現的時間、表現程度、發展過程、死亡前特征及死亡時間等。觀察期間，如有小鼠死亡，則進行病理檢查；如無死亡，實驗結束后對小鼠實施安樂死，顯微鏡下觀察其心、肝、肺、脾、腎和胃腸臟器的顏色、形態及大小的變化情況。

2.3 桄榔子醇提物的鎮痛實驗

2.3.1 熱板法 參考文獻[5-6]中方法，取小鼠90只，♀，適應性飼養1周后，禁食不禁水過夜。將小鼠置于55 ℃恒溫智能熱板儀中，截至時間設定為30 s，測定3次，記錄每只小鼠的舔爪潛伏期（即基礎痛閾值），剔除跳躍的小鼠。選取平均基礎痛閾值在8～18 s的小鼠進行實驗。按照基礎痛閾值大小，采用隨機區組設計法將小鼠隨機分為桄榔子醇提物高、中、低劑量組[6.5、3.25、1.625 g/kg（以醇提物計，下同），灌胃]和陽性對照組（嗎啡0.005 g/kg，腹腔注射）、空白對照組（蒸餾水，灌胃），每組9只。桄榔子醇提物高、中、低劑量分別為小鼠最大給藥劑量的1/4、1/8、1/16，嗎啡劑量為根據體表面積換算的人臨床等效劑量。單次給藥后，分別于給藥后30、60、90 min測定各組小鼠的舔爪潛伏期。

2.3.2 醋酸扭體法 參考文獻[7-8]中方法，取小鼠60只，♂，禁食不禁水過夜。按體質量大小，采用隨機區組設計法將小鼠隨機分為桄榔子醇提物高、中、低劑量組（6.5、3.25、1.625 g/kg，灌胃）和陽性對照組（洛索洛芬鈉0.023 g/kg，灌胃）、模型對照組（蒸餾水，灌胃），每組12只。洛索洛芬鈉劑量為根據體表面積換算的人臨床等效劑量的2倍。各組小鼠單次給藥后30 min，沿腹膜壁緩慢注入0.8%的醋酸生理鹽水溶液，記錄20 min內各組小鼠的扭體次數，計算扭體抑制率。扭體抑制率（%）=（模型對照組扭體次數-給藥組扭體次數）/ 模型對照組扭體次數×100%。

2.3.3 福爾馬林致痛法 參考文獻[9-10]中方法，取小鼠70只，♂，禁食不禁水過夜。按體質量大小，采用隨機區組設計法將小鼠隨機分為桄榔子醇提物高、中、低劑量組（6.5、3.25、1.625 g/kg，灌胃）和陽性對照組（嗎啡0.005 g/kg，腹腔注射）、模型對照組（蒸餾水，灌胃），每組14只。單次給藥后30 min，各組小鼠右后足皮下注射1%福爾馬林溶液20 μL，立刻放入觀察籠中，記錄0～5 min和10～40 min內各組小鼠的舔爪總時間，計算舔爪抑制率。舔爪抑制率（%）=（模型對照組舔爪總時間-給藥組舔爪總時間）/ 模型對照組舔爪總時間×100%。

2.4 桄榔子醇提物的抗炎實驗

2.4.1 小鼠耳腫脹法 參考文獻[11-12]中方法，取小鼠50只，♂，禁食不禁水過夜。按體質量大小，采用隨機區組設計法將小鼠隨機分為桄榔子醇提物高、中、低劑量組（6.5、3.25、1.625 g/kg，灌胃）和陽性對照組（洛索洛芬鈉0.023 g/kg，灌胃）、模型對照組（蒸餾水，灌胃），每組10只，每天給藥1次，連續給藥3 d。于末次給藥后30 min，在小鼠左耳正反面涂抹二甲苯20 μL，2.5 h后處死小鼠，用8 mm打孔器打下小鼠左右耳，稱質量后，計算左右耳質量差值，即耳腫脹度。耳腫脹度（mg）=左耳質量（mg）-右耳質量（mg），計算腫脹抑制率=（模型對照組耳腫脹度-給藥組耳腫脹度）/模型對照組耳腫脹度×100%。

2.4.2 大鼠足腫脹法 參考文獻[13]中方法，取大鼠60只，♂，禁食不禁水過夜。按體質量大小，采用隨機區組設計法將大鼠隨機分為桄榔子醇提物高、中、低劑量組（4.5、2.25、1.125 g/kg，灌胃）和陽性對照組（洛索洛芬鈉0.016 g/kg，灌胃）、模型對照組（蒸餾水，灌胃）、空白對照組（蒸餾水，灌胃），每組10只。桄榔子醇提物給藥劑量為根據體表面積換算的上述小鼠實驗的等效劑量，洛索洛芬鈉劑量為根據體表面積換算的人臨床等效劑量的2倍。每天給藥1次，連續給藥3 d。末次給藥后30 min，除空白對照組大鼠外，其余各組大鼠左后足趾皮下注射弗式完全佐劑（1 mg/mL）100 μL致炎，復制大鼠足腫脹模型，再連續給藥7 d。用足趾容積測量儀分別于致炎前0 h和致炎后4 h、1 d、3 d、5 d、7 d測量各組大鼠左后足容積（至踝關節處），計算足腫脹度。足腫脹度（mL）=致炎后足體積（mL）-致炎前足體積（mL）。

2.5 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行數據處理，所有數據均以x±s表示，采用單因素方差分析進行多組間比較，采用LSD-t檢驗進行組間兩兩比較。P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠急性毒性實驗結果

與溶劑對照組比較，桄榔子醇提物組小鼠體質量增長趨勢無明顯變化。給藥前和實驗結束時，兩組小鼠的體質量差異無統計學意義（P>0.05）。觀察期間，各組小鼠活動正常、飲食飲水正常、大便正常、毛色光澤，無中毒癥狀，未發現死亡情況。實驗結束后，顯微鏡下觀察桄榔子醇提物組小鼠心、肝、肺、脾、腎和胃腸臟器的顏色、形態及大小與溶劑對照組比較無異常變化。各組小鼠體質量的測定結果見表1。

3.2 小鼠熱板法實驗結果

給藥后30 min，桄榔子醇提物高、中劑量組和陽性對照組小鼠的舔爪潛伏期較空白對照組明顯延長（P<0.05或P<0.01）；給藥后60 min，桄榔子醇提物高劑量組和陽性對照組小鼠的舔爪潛伏期較空白對照組明顯延長（P<0.01）；給藥后90 min后，各組小鼠的舔爪潛伏期差異均無統計學意義（P>0.05）。各組小鼠不同時間的舔爪潛伏期的測定結果見表2。

3.3 小鼠醋酸扭體法實驗結果

與模型對照組比較，桄榔子醇提物高、中、低劑量組和陽性對照組小鼠的扭體次數均明顯減少（P<0.01），且扭體抑制率隨桄榔子醇提物劑量的增加而增加。各組小鼠的扭體次數和扭體抑制率的測定結果見表3。

3.4 小鼠福爾馬林致痛法實驗結果

與模型對照組比較，桄榔子醇提物高、中、低劑量組和陽性對照組小鼠0～5 min和10～40 min兩個時間段內的舔爪總時間均明顯縮短（P<0.05或P<0.01），10～40 min時間段的縮短程度強于0～5 min，舔爪抑制率隨桄榔子醇提物劑量的增加而增加。各組小鼠的舔爪總時間和舔爪抑制率的測定結果見表4。

3.5 小鼠二甲苯致耳腫脹實驗結果

與模型對照組比較，桄榔子醇提物高、中、低劑量組和陽性對照組小鼠左耳質量和耳腫脹度均明顯降低（P<0.05或P<0.01），且腫脹抑制率隨桄榔子醇提物劑量的升高而增加。各組小鼠耳腫脹度與腫脹抑制率的測定結果見表5。

3.6 大鼠弗式完全佐劑致足腫脹實驗結果

與空白對照組比較，模型對照組大鼠致炎后4 h、1 d、3 d、5 d、7 d的足腫脹度均明顯增加（P<0.01）。與模型對照組比較，桄榔子醇提物高劑量組和陽性對照組大鼠致炎后4 h、1 d、3 d、5 d、7 d的足腫脹度均明顯降低（P<0.01）；桄榔子醇提物中劑量組大鼠致炎后1、3、5、7 d的足腫脹度均明顯降低（P<0.01）；桄榔子醇提物低劑量組大鼠致炎后1、5、7 d的足腫脹度均明顯降低（P<0.01）。其中，桄榔子醇提物高劑量組抑炎效果最強。各組大鼠致炎后不同時間足腫脹度的測定結果見表6。

4 討論

整個實驗過程中，由于實驗動物個體差異和實驗誤差，每組動物數量以實際數量為準。

毒理學研究是藥物臨床前研究的中心環節，是評價藥物安全性的重要指標[14]。本研究通過小鼠灌胃最大給藥量的急性毒性實驗觀察桄榔子醇提物的用藥安全性。結果顯示，小鼠灌胃桄榔子醇提物的劑量為26 g/kg時，未見小鼠死亡及毒副作用出現，同時，小鼠的主要臟器病理觀察也未見與給藥相關的變化出現，提示小鼠灌胃桄榔子醇提物相對安全。因此，采用急毒劑量的1/4作為高劑量，用于后續實驗研究。但是，長期毒理學研究仍需要進一步進行。

熱板法和醋酸扭體法是經典的評價藥物中樞和外周鎮痛活性的實驗方法之一[15]。熱板法是由熱刺激通過爪部的初級感覺神經傳入中樞引起的疼痛，能同時反映出藥物中樞鎮痛作用的時效和量效關系。醋酸扭體法是由低濃度醋酸刺激腹膜壁引起的炎癥性疼痛，主要是外周神經參與，僅能反映出藥物外周鎮痛作用的量效關系，缺乏特異性。兩種方法結合可以初步反映出藥物鎮痛作用部位、作用強度和作用時間。嗎啡是具有明顯中樞鎮痛作用的藥物，因此本文以嗎啡為陽性對照藥物探討桄榔子醇提物的鎮痛活性是否與中樞神經系統有關，嗎啡的給藥途徑不影響實驗的結果。本實驗結果顯示，與空白對照組比較，桄榔子醇提物高劑量可明顯延長小鼠熱板法實驗中的舔爪潛伏期，作用時間可持續到給藥后60 min；桄榔子醇提物高、中、低劑量均可明顯減少醋酸所致的小鼠扭體次數。由此表明桄榔子醇提物具有較強的中樞和外周鎮痛活性。為進一步驗證桄榔子醇提物的中樞和外周鎮痛活性，本文還采用福爾馬林致痛實驗，通過考察0～5 min刺激初級感覺神經所致的舔爪總時間反映桄榔子醇提物的中樞鎮痛活性，10～40 min炎癥因子分泌所致的舔爪總時間反映桄榔子醇提物的外周鎮痛活性[16-17]。本實驗結果顯示，桄榔子醇提物可明顯縮短2個時間段小鼠的舔爪總時間，且第二個時間段比第一個時間段的縮短程度更明顯。結合上述實驗結果進一步確定，桄榔子醇提物具有較強的中樞和外周鎮痛活性，其中，外周鎮痛活性較強。

二甲苯致小鼠耳腫脹和弗式完全佐劑致大鼠足腫脹，是以炎性滲出即水腫為主要特征的急性和慢性炎癥動物模型，常用于評價藥物的抗炎活性[18-19]。本實驗結果顯示，與模型對照組比較，桄榔子醇提物高、中、低劑量均可明顯抑制二甲苯致小鼠耳腫脹度，同時，桄榔子醇提物高劑量從致炎4 h開始即可顯著抑制大鼠的足腫脹度，作用可持續到致炎后第7天，表明桄榔子醇提物具有較強的抗炎活性，對慢性炎癥效果優于急性炎癥。

綜上所述，本研究采用多種動物疼痛模型和炎癥動物模型驗證桄榔子醇提物的鎮痛和抗炎活性。研究結果表明，桄榔子醇提物對模型動物具有明顯的鎮痛和抗炎活性，從而可為其臨床應用提供一定的科學依據。但具體機制尚不明確，仍需要進一步研究。

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（收稿日期：2018-06-15 修回日期：2018-10-15）

（編輯：鄒麗娟）