甘蔗葉乙醇提取物的不同溶劑萃取部位對CCl4致小鼠急性肝損傷的保護作用研究

郝二偉 李揚 趙媛媛 鄧家剛 侯小濤

中圖分類號 R284 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）01-0084-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.01.18

摘 要 目的：篩選甘蔗葉具有抗肝損傷作用的活性部位。方法：以80%乙醇提取甘蔗葉得到乙醇提取物浸膏，用水分散后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，得到相應極性部位萃取物，剩余為水部位萃取物。將108只小鼠隨機分為空白A組[0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）與3.5%聚山梨酯80溶液]、空白B組（純凈水）、模型組（純凈水）、聯苯雙酯組（陽性對照，0.2 g/kg）、甘蔗葉乙醇提取物組和甘蔗葉不同極性部位（石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水）組（以生藥量計給藥量均為22.92 g/kg，以0.5% CMC-Na與3.5%聚山梨酯80溶液為溶劑），每組12只。每天灌胃給藥1次，連續給藥12 d。末次給藥1 h后，除空白A、B組外，其余各組小鼠均腹腔注射0.15%四氯化碳（CCl4）-花生油（0.1 mL/10 g）溶液復制急性肝損傷模型。16 h后，觀察小鼠一般情況，并檢測其血清中丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）含量，觀察其肝組織病理形態學變化并進行Ishak評分。結果：與空白B組比較，空白A組小鼠各指標均無明顯差異（P>0.05）。與空白A組比較，模型組小鼠毛發稀疏，體型消瘦，活動稍顯遲緩；血清中ALT、AST含量顯著升高（P<0.01）；肝小葉結構破壞嚴重，肝索和肝竇結構不清晰，肝索排列紊亂，Ishak評分顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組小鼠一般情況均有所好轉；聯苯雙酯組、甘蔗葉乙醇提取物組和甘蔗葉乙酸乙酯部位組小鼠血清中ALT、AST含量顯著降低（P<0.05或P<0.01），且肝組織的病理損傷也明顯減輕，Ishak評分顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結論：甘蔗葉乙醇提取物的乙酸乙酯部位為其具有抗CCl4致小鼠急性肝損傷作用的活性部位。

關鍵詞 甘蔗葉；乙醇提取物；急性肝損傷；活性部位；小鼠

Study on Protective effects of Different Solvent Parts of Ethanol Extract from Saccharum officinarum Leaves on CCl4-induced Acute Liver Injury of Mice

HAO Erwei1，2，LI Yang1，3，ZHAO Yuanyuan1，3，DENG Jiagang1，2，HOU Xiaotao1，2，3（1.Guangxi Key Lab of Efficacy Study on Chinese Materia Medica， Guangxi University of TCM， Nanning 530200， China；2.Collaborative Innovation Center of Functional Ingredients Study of Agricultural Residues， Guangxi University of TCM， Nanning 530200， China；3.College of Pharmacy， Guangxi University of TCM， Nanning 530200， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To screen the active part of Saccharum officinarum leaves against liver injury. METHODS： The S. officinarum leaves were extracted with 80% ethanol to obtain ethanol extract， after dispersed with water， ethanol extract was respectively extracted with petroleum ether， ethyl acetate and n-butanol to obtain corresponding polar parts. The residual part was water part. Totally 108 mice were randomly divided into blank group A （0.5% CMC-Na and 3.5% polysorbate 80 solution）， blank group B （purified water）， model group （purified water）， biphenyl diester group （positive control， 0.2 g/kg）， S. officinarum leaves ethanol extract group， different polar parts of S. officinarum leaves group （petroleum ether， ethyl acetate， n-butanol， water， 22.92 g/kg crude drug， 0.5% CMC-Na and 3.5% polysorbate 80 solution as solvent）， with 12 mice in each group. They were given relevant medicine intragastrically once a day， for consecutive 12 d. 1 h after last medication， except for blank group A and blank group B， mice in other groups were given 0.15% CCl4 peanut oil （0.1 mL/10 g） solution to induce acute liver injury model. 16 h later， general information of mice was observed， and the serum contents of ALT and AST were determined. The liver histopathological changes were observed and the Ishak scores were scored. RESULTS： Compared with blank group B， each index of blank group A had no significant difference （P>0.05）. Compared with blank group A， model group had sparse hair and slow movement， and was emaciated. Serum contents of ALT and AST were increased significantly （P<0.01）. The structure of hepatic lobule was severely damaged； the structure of hepatic cord and sinus was not clear； the arrangement of hepatic cord was disordered， and the Ishak score was significantly increased （P<0.01）. Compared with model group， general information of mice was improved in administration groups. Serum contents of ALT and AST were decreased in biphenyl diester group， S. officinarum leaf ethanol extract group and S. officinarum leaf ethyl acetate group （P<0.05 or P<0.01）. The pathological damage of liver tissue was significantly relieved， and Ishak score was significantly reduced （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： The ethyl acetate part of ethanol extract from S. officinarum leaves is active part against CCl4-induced acute liver injury of mice.

KEYWORDS Saccharum officinarum leaves； Ethanol extract； Acute liver injury； Active part； Mice

甘蔗葉為禾本科（Poaceae）甘蔗屬（Saccharum）植物甘蔗（Saccharum officinarum Linn.）和竹蔗（Saccharum sinensis Roxb.）的葉。其中，甘蔗又稱秀貴甘蔗，主要分布于我國臺灣、福建、廣東、海南、廣西、四川、云南等地區；竹蔗又稱草甘蔗，在江西、湖南、福建、廣東、廣西、四川、云南等熱帶地區廣泛種植[1]。甘蔗除了作為榨糖的重要原料外，其莖稈、葉片和蔗梢還可入藥、作家畜飼料、制酒精等。甘蔗葉作為甘蔗收獲后的廢棄物，年產量超過1 800萬噸，資源十分豐富，但甘蔗葉大多未被很好地利用，造成了嚴重的資源浪費與環境污染[2]。目前，對于甘蔗葉藥用研究的報道較少，除有報道甘蔗葉黃酮類成分具有一定的抗氧化活性外[3]，尚未見其他研究報道。本課題組在前期對甘蔗葉進行了較為系統的研究，發現甘蔗葉不同極性提取物對腎上腺素、四氧嘧啶、鏈佐霉素誘導的3種糖尿病模型動物均具有一定的降血糖作用，對體外培養的腫瘤細胞株具有一定的抑制作用，對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌均有明顯的體外抗菌作用，且甘蔗葉總黃酮具有一定的抗炎活性[4-9]。在本研究中，本課題組將繼續考察甘蔗葉80%乙醇提取物及其不同溶劑萃取部位對四氯化碳（CCl4）致小鼠急性肝損傷的改善作用，明確甘蔗葉保護肝損傷的活性部位，為開發具有保肝作用的農作物廢棄物中藥資源提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

ELX 680型酶標儀（美國Bio-Tek公司）；RM 2235組織切片機（德國Leica公司）；CX 41正置顯微鏡（美國奧林巴斯公司）；D 5100數碼相機（日本尼康公司）； DFC 295 IMS圖像分析系統（武漢華聯科生物技術有限公司）。

1.2 藥品與試劑

甘蔗葉采集于廣西農業科學院甘蔗研究所32號試驗地，由廣西中醫藥大學寧小清高級實驗師鑒定為禾本科植物甘蔗（Saccharum officinarum Linn.）的葉；聯苯雙酯滴丸（北京協和藥廠，批號：14120104，規格：1.5 mg）；丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20160515、20160515）；其他試劑均為市售分析純。

1.3 動物

SPF級KM小鼠108只，♀♂各半，體質量（20±2） g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK（桂）2014-0002。將小鼠置于溫度為22～25 ℃、相對濕度為50%～60%的條件下飼養，期間自由采食、飲水，適應性飼養1周后用于實驗。

2 方法

2.1 甘蔗葉提取物的制備

取甘蔗葉40 kg，打成粗粉，加入80%乙醇溶液40 L，浸漬1周，過濾。取14 L浸出液減壓濃縮，得到80%乙醇浸膏，干燥，即得甘蔗葉80%乙醇提取物，得率為3.39%。取甘蔗葉乙醇浸出液26 L，加入2～3倍量石油醚，輕輕振搖，靜置分層，吸取上層石油醚層后再倒入新的石油醚進行萃取，每次萃取靜置24 h以上，直至萃取液萃至無色為宜，合并萃取液，旋轉蒸發儀濃縮回收石油醚，得到石油醚浸膏，將浸膏于水浴鍋上揮干溶劑，至浸膏用玻璃棒絞起后不挑絲，將浸膏轉移入真空干燥箱繼續干燥，直至浸膏質量基本不減少且真空干燥箱中的硅膠不再轉為粉紅色，所得干膏即為甘蔗葉石油醚部位萃取物，得率為0.51%。石油醚萃取完后，依次以乙酸乙酯、正丁醇按上述方法進行萃取，將萃取液減壓濃縮，按上述方法干燥，分別得到甘蔗葉乙酸乙酯、正丁醇部位萃取物，得率分別為0.48%、0.52%。剩余浸出液在旋轉蒸發儀濃縮后，在電磁爐上蒸干，得到水部位浸膏，按上述方法干燥，所得干膏即為甘蔗葉水部位萃取物，得率為2.69%。

2.2 分組、造模與給藥

取108只KM小鼠隨機分為9組，每組12只，分別為空白A組、空白B組、模型組、聯苯雙酯組（陽性對照）、甘蔗葉乙醇提取物組、甘蔗葉石油醚部位組、甘蔗葉乙酸乙酯部位組、甘蔗葉正丁醇部位組和甘蔗葉水部位組。聯苯雙酯組小鼠給藥劑量為0.2 g/kg（按人臨床用量折算而得）；甘蔗葉各提物組小鼠的給藥劑量以生藥計均為22.92 g/kg（前期預實驗結果顯示，甘蔗葉乙醇提取物的該劑量為有效劑量）；空白A組小鼠給予等體積的0.5%CMC-Na與3.5%的聚山梨酯80溶液，空白B組小鼠給予純凈水。各組小鼠均灌胃給藥，每天1次，連續給藥12 d。末次給藥1 h后，除空白A、B組外，其余各組小鼠均腹腔注射0.15%CCl4-花生油（0.1 mL/10 g）溶液制備急性肝損傷模型[10]，空白A、B組小鼠腹腔注射等量的花生油。

2.3 一般情況觀察及血清中ALT、AST檢測

造模后小鼠禁食不禁水16 h，觀察小鼠一般情況后，經眼球后靜脈叢取血，以3 500 r/min離心10 min，分離血清，置于-80 ℃冰箱中保存。按照試劑盒說明書操作，檢測各組小鼠血清中ALT、AST含量。

2.4 肝組織病理形態學觀察

采血后處死小鼠，迅速解剖，取出肝臟，剪取每個樣本相同位置的新鮮肝右葉，浸入4%多聚甲醛中固定，常規制備肝組織切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后置于顯微鏡下觀察病理切片并采集圖像，根據Ishak評分系統[8]，對門管區周圍或周圍間隔區交界面肝炎（碎片狀壞死）、融合性壞死、局灶性（斑狀）溶解性壞死，凋亡及局灶性炎癥、門管區炎癥4個項目進行評分。（1）門管區周圍或周圍間隔區交界面肝炎（碎片狀壞死）：無，0分；輕微（局灶性，少數門管區），1分；輕微/中等（局灶性，大多數門管區），2分；中等（連續性，<50%的門管區及間隔區），3分；嚴重（連續性，>50%的門管區及間隔區），4分。（2）融合性壞死：無，0分；局灶性融合性壞死，1分；部分區域3區壞死，2分；大多數區域3區壞死，3分；3區壞死+偶見門管區-中心靜脈（P-C）橋接，4分；3區壞死+多發性P-C橋接，5分；全小葉或多發性小葉壞死，6分。（3）局灶性（斑狀）溶解性壞死/凋亡及局灶性炎癥：無，0分；每10倍視野下有1個壞死區或更少，1分；每10倍視野下有2～4個壞死區，2分；每10倍視野下有5～10個壞死區，3分；每10倍視野下有10個以上壞死區，4分。（4）門管區炎癥：無，0分；輕度，部分或所有門管區，1分；中度，部分或所有門管區，2分；中度/嚴重，所有門管區，3分；嚴重，所有門管區，4分。

2.5 統計學處理

采用SPSS 16.0軟件進行統計分析。數據以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差性齊時組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，不齊性時采用非參數檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 甘蔗葉不同溶劑提取物對CCl4致急性肝損傷模型小鼠一般情況的影響

小鼠損傷前被毛光滑油亮，濃密而有光澤，形態較為豐滿，活動迅速靈敏，眼睛靈動明亮，大便呈黑褐色顆粒狀。造模后，各造模組小鼠均有不同程度的精神頹廢，活動遲鈍，少動，聚堆等現象。其中，以模型組小鼠最為明顯，表現為毛發稀疏，毛色較為晦暗且無光澤，體型消瘦，活動稍顯遲緩，眼睛渾濁。甘蔗葉石油醚、正丁醇、水部位組小鼠被毛稍顯暗淡，毛發密度較空白A組稀疏，體型稍偏瘦，行動較空白A組小鼠稍遲鈍。聯苯雙酯組、甘蔗葉乙醇提取物組和甘蔗葉乙酸乙酯部位組小鼠經肉眼觀察外觀上均無顯著差異，毛發較為濃密，毛色光澤，體型較為豐滿，活動快捷靈敏，眼睛靈動明亮。

3.2 甘蔗葉不同溶劑提取物對CCl4致急性肝損傷模型小鼠血清中ALT、AST含量的影響

與空白B組比較，空白A組小鼠血清中ALT、AST含量差異無統計學意義（P>0.05）；與空白A組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST含量顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，聯苯雙酯組、甘蔗葉乙醇提取物組和甘蔗葉乙酸乙酯部位組小鼠血清中ALT、AST含量顯著降低（P<0.05或P<0.01），其余各組差異無統計學意義（P>0.05）。各組小鼠血清中ALT、AST含量測定結果見表1。

3.3 甘蔗葉不同溶劑提取物對CCl4致急性肝損傷模型小鼠肝組織病理形態學的影響

3.3.1 病理觀察結果 空白A組與空白B組小鼠肝組織均無明顯病理形態學改變，小鼠肝小葉結構清晰完整，小葉內肝細胞索排列整齊；細胞核大而圓，核仁明顯；肝細胞大小均勻，胞漿豐富，以中央靜脈為中心呈放射狀排列；匯管區無纖維組織增生，無炎性細胞浸潤。模型組小鼠肝小葉結構破壞嚴重，肝索和肝竇結構不清晰，肝索排列紊亂，有較多的成纖維細胞出現，纖維結締組織增生，出現多發性P-C橋接，部分可見假小葉形成及不同程度灶性壞死，脂肪變性呈空泡狀，肝臟匯管區擴大；肝組織中有明顯炎性細胞浸潤。聯苯雙酯組小鼠肝小葉和匯管區結構完整，未見假小葉形成，部分匯管區出現少量炎性細胞浸潤，纖維結締組織增生減少，整體病變程度明顯輕于模型組。甘蔗葉乙醇提取物組小鼠肝小葉結構輕度紊亂，肝細胞索排列較正常，炎細胞浸潤較少，未見明顯的灶性壞死及脂肪變性，匯管區纖維結締組織增生減少，整體病變程度明顯輕于模型組。甘蔗葉石油醚、正丁醇、水部位組小鼠肝小葉結構紊亂程度較為嚴重，偶見P-C橋接壞死，部分可見假小葉形成及脂肪變性，肝組織中有明顯炎性細胞浸潤，纖維結締組織增生較多，整體病變程度與模型組接近。甘蔗葉乙酸乙酯部位組小鼠肝小葉結構輕度紊亂，肝細胞索排列較正常，部分匯管區出現炎性細胞浸潤，部分脂肪變性，匯管區-匯管區之間、匯管區與中央靜脈之間見少許融合性壞死，匯管區纖維結締組織增生減少，整體病變程度輕于模型組。各組小鼠肝組織病理形態學觀察結果見圖1。

3.3.2 Ishak評分結果 模型組小鼠的評分分布在9～16分之間，聯苯雙酯組小鼠的評分分布在7～11分之間，甘蔗葉乙醇提取物組小鼠的評分分布在9～13分之間，甘蔗葉石油醚部位組小鼠的評分分布在10～15之間，甘蔗葉乙酸乙酯部位組小鼠的評分分布在8～12之間，甘蔗葉正丁醇部位組小鼠的評分分布在9～14之間，甘蔗葉水部位組小鼠的評分分布在11～15之間。與空白B組比較，空白A組小鼠評分差異無統計學意義（P>0.05）；與空白組A比較，模型組小鼠的評分顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，聯苯雙酯組、甘蔗葉乙醇提物組和甘蔗葉乙酸乙酯部位組小鼠評分顯著降低（P<0.05或P<0.01），其余各組差異無統計學意義（P>0.05）。各組小鼠肝組織Ishak評分結果見表2。

4 討論

“農作物廢棄物藥用研究”是本課題組成員鄧家剛教授首次提出的概念[11]，主要倡導以農民種植的大宗農作物中非主要經濟目標產品的部分（如甘蔗葉、芒果葉、香蕉葉、西瓜葉、木薯葉等）為研究對象，開展其藥用價值的基礎和應用基礎研究。甘蔗葉為廣西大宗農作物，也是世界各國廣泛種植的農作物，對其進一步開發利用具有非常高的經濟和社會價值。前期開展的甘蔗葉80%乙醇提取物的急性毒性實驗結果表明，甘蔗葉80%乙醇提取物一日最大給藥量為91.68 g/kg（以生藥量計），按體表面積換算為成人的一日最大給藥量為711.25 g/d，說明甘蔗葉80%乙醇提取物是安全的。

本研究系統地考察了甘蔗葉乙醇提取物及其石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等不同極性部位的抗肝損傷作用，并以治療病毒性肝炎和藥物性肝損傷引起轉氨酶升高的常用藥物聯苯雙酯作為陽性對照進行藥效觀察。結果顯示，甘蔗葉乙醇提取物組和甘蔗葉乙酸乙酯部位組小鼠血清中ALT、AST含量均明顯低于模型組（P<0.05或P<0.01）。HE染色結果也顯示，甘蔗葉乙醇提取物組和甘蔗葉乙酸乙酯部位組小鼠肝組織損傷程度較模型組明顯減輕，Ishak評分顯著低于模型組（P<0.05）。實驗結果提示，甘蔗葉80%乙醇提取物及其乙酸乙酯部位對CCl4致急性肝損傷小鼠均有一定的改善作用，且作用效果與聯苯雙酯類似，也提示甘蔗葉保肝降酶的活性部位為乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位。

中藥及其提取物對肝損傷有一定的促進再生和修復作用[12-15]，在急性肝損傷治療方面有一定優勢和前景。本研究結果揭示了甘蔗葉乙醇提取物抗肝損傷的有效部位，為甘蔗葉化學成分和物質基礎研究提供了線索。本課題組后期將對甘蔗葉乙醇提取物乙酸乙酯部位中的化學成分進行確認，并對其抗肝損作用機制進行深入研究，為將甘蔗葉提取物開發為治療化學性肝損傷的健康產品提供依據。

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（收稿日期：2018-09-04 修回日期：2018-11-08）

（編輯：林 靜）