不同炮制方法對林蛙油質量的影響

徐 陽，單柏宇，馬玉蓮，房 闊，鮑慧瑋

(1.長春醫學高等專科學校藥學與食品學院，吉林長春130031；2.白城市食品藥品檢驗所，吉林白城137000；3.長春中醫藥大學藥學院，吉林長春130117)

林蛙油，又稱哈蟆油，是中國林蛙(RanatemporariachensinensisDavid)中雌性林蛙的輸卵管干燥形成的脂肪狀物，具有補腎益精，養陰潤肺的功效[1]。隨著全民健身意識的提升，目前林蛙油常常作為一種較名貴的“滋補佳品”流通，食用方法也由原來單一的傳統沖泡法衍變出多種烹飪及處理方法[2-3]。

對于中藥林蛙油來說，僅依靠幾種化學成分含量很難全面評價其質量，總醇提物含量、脂溶性成分含量和酸值無疑是油脂類物質的評價依據，而作為主要活性成分之一的水溶性蛋白，也是衡量指標之一[4-7]。本文利用7種不同的炮制方法處理林蛙油，通過對其總醇提物、脂溶性成分、酸值和水溶性蛋白的測定，綜合比較不同炮制方法對林蛙油質量的影響，為林蛙油的進一步市場開發提供依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

TU1810型紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；RE-3000型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；AB135-S型分析天平(澳大利亞梅特勒公司)；FA1004B電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)。

林蛙油(吉林省鼎源特產經貿有限公司，批號：20170801)，經由長春中醫藥大學中藥鑒定教研室肖井雷副教授鑒定為正品，符合《中華人民共和國藥典》(2015版一部)項下相關規定。

牛血清白蛋白對照品(北京索萊寶科技有限公司，批號：605U056)；硫酸銅、氫氧化鈉、碘化鉀、酒石酸鉀鈉、石油醚(沸程60～90℃)、無水乙醇、酚酞試液、乙醚，均為分析純，購于北京化工廠。

1.2 不同林蛙油炮制方法

清炒：取林蛙油適量，粉碎，文火加熱至褐色，取出，放涼。

酒炙：取林蛙油適量，粉碎，加十分之一的量的黃酒拌勻，悶透，用文火炒至焦褐色，取出，放涼。

炒炭：取林蛙油適量，粉碎，置熱鍋內，用武火炒至焦黑色，噴淋清水少許，取出，晾干。

煮制：取林蛙油適量，粉碎，加8倍水煮30 min，取出，干燥。

燉制：取林蛙油適量，粉碎，加入20%的量的水，燉至水完全被吸盡時，放涼，取出，干燥。

烘干(40℃)：取林蛙油適量，粉碎，置40℃烘箱中烘干4 h，取出，晾干。

烘干(100℃)：取林蛙油適量，粉碎，置100℃烘箱中烘干4 h，取出，晾干。

2 實驗結果

2.1 不同炮制方法的林蛙油總醇提物的測定

稱取不同林蛙油炮制品各10 g，加8倍無水乙醇，80℃水浴回流提取2次，每次30 min，過濾，收集濾液，旋轉蒸發溶劑，轉移至錐形瓶中并干燥至恒重。按照公式(1)，計算各供試品中總醇提物的含量，結果見表1。

(1)

其中，w1為總醇提物的含量，A1為干燥后供試品和容器的質量(g)，A2為容器的質量(g)，W為加入供試品的總質量(g)。

表1 不同炮制方法的林蛙油總醇提物含量測定結果

2.2 不同炮制方法的林蛙油脂溶性成分的測定

稱取不同林蛙油炮制品各10 g，加8倍石油醚，75℃水浴回流提取2次，每次30 min，過濾，分別收集藥渣和濾液，藥渣備用，濾液旋轉蒸發溶劑，轉移至錐形瓶中并干燥至恒重[8]。按照公式(2)，計算各供試品中脂溶性成分的含量，結果見表2。

(2)

其中,w2為脂溶性成分的含量，A1為干燥后供試品和容器的質量(g),A2為容器的質量(g),W為加入供試品的總質量(g)。

表2 不同炮制方法的林蛙油脂溶性成分含量測定結果

2.3 不同炮制方法的林蛙油酸值的測定

取“2.2”提取并稱定質量的石油醚提取物，加乙醇-乙醚(1∶1)混合液5 mL，臨用前加酚酞指示液0.1 mL，用NaOH滴定液(0.1 mol/L)，調至微顯粉紅色，振搖使其完全溶解，用NaOH滴定液(0.1 mol/L)滴定至粉紅色，持續30 s不褪色[9]。按照公式(3)，計算各供試品的酸值，結果見表3。

(3)

其中，x為供試品的酸值，A為消耗氫氧化鈉滴定液的體積(mL)，W為加入供試品的總質量(g)。

2.4 雙縮脲法測定林蛙油不同炮制品中水溶性蛋白含量

2.4.1 雙縮脲試液的配制

取硫酸銅1.5 g、酒石酸鉀鈉6.0 g和碘化鉀5.0 g，加水500 mL溶解，邊攪拌邊加入10%氫氧化鈉溶液300 mL，用水稀釋至1000 mL，混勻，即得。

2.4.2 對照品溶液的制備

精密稱取牛血清白蛋白對照品適量，加水溶解并制成濃度為10 mg/mL的對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備

稱取“2.2”保存的未炮制哈蟆油濾渣0.1 g，加pH為12的氫氧化鈉溶液5 mL，混勻，渦旋混合3 min，靜置30 min，加20 mL雙縮脲試液，反復倒置10次混勻，靜置30 min，再次搖勻，2000 r/min離心2 min，取上清液，即得。

2.4.4 線性關系考察

精密量取對照品溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分別置具塞試管中，各加水至1.0 mL，再分別加入雙縮脲試液4.0 mL，立即混勻，室溫放置30 min，依照《中華人民共和國藥典》(2015年版四部)紫外-可見分光光度法(通則0401)，在540 nm的波長處測定吸光度[10-11]；同時以0號管作為空白。以吸光度值為縱坐標、濃度為橫坐標繪制標準曲線，計算回歸方程。得到的線性回歸方程為y=0.0258x-0.0019(R2=0.9985)，線性范圍為0～10 mg/mL(圖1)。

圖1 蛋白質含量標準曲線

2.4.5 精密度試驗

取同一供試品溶液6份，在540 nm波長下連續測定6次。結果水溶性蛋白吸光度的RSD為1.91%，說明該方法的精密度良好。

2.4.6 重復性試驗

取供試品適量，精密稱取6份，按“2.4.3”制備供試品溶液，在540 nm的波長處測定。結果水溶性蛋白的平均含量為39.28%、RSD為1.98%，表明該方法重復性良好。

2.4.7 穩定性試驗

取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、10 h在540 nm的波長處測定，結果水溶性蛋白吸光度的RSD為1.53%，表明供試品溶液在10 h內穩定。

2.4.8 回收率試驗

稱取已知含量的供試品粉末6份，每份約0.05 g，加入對照品溶液2 mL，再加入pH為12的氫氧化鈉溶液3 mL，繼續按“2.4.3”制備供試品溶液，在540 nm的波長處測定，結果見表4。

表4 加樣回收率結果

2.4.9 樣品測定

取“2.2”保存的各炮制品濾渣，每種樣品稱取5份，每份約0.1 g，按“2.4.3”制備供試品溶液，在540 nm的波長處測定，計算平均水溶性蛋白含量,結果見表5。

表5 不同炮制方法的林蛙油中水溶性蛋白含量測定結果

3 結論

林蛙油為油脂狀物，總醇提物含量和脂溶性成分含量測定是指分別用不同的溶劑對藥材中的可溶性物質進行測定，以其含量的高低評價藥材的品質。本文對7種不同炮制方法處理的炮制品進行測定，烘干(40℃和100℃)、煮制、燉制與未炮制林蛙油的總醇提物含量接近，說明烘干(40℃和100℃)、煮制、燉制對總醇提取物的影響較小，酒炙、清炒和炒炭對總醇提物的影響較大，大量的化合物已經被轉化成新的化合物，藥效方面可能會有較大差異；脂溶性成分是重要的功能營養物質，對抗疲勞和增強免疫力等方面均有重要作用，隨著炮制所用溫度的升高，脂溶性化合物的含量也隨之下降，溫度可破壞脂肪酸類成分。其中被破壞程度：燉制>酒炙>煮制>炒炭>烘干(100℃)>清炒>烘干(40℃)>未炮制。

酸值表現林蛙油中游離脂肪類成分的含量，游離脂肪酸類化合物對于人體具有重要的生理活性，是林蛙油中不可缺少的營養成分之一，通過實驗表明，煎制和燉制的方法使林蛙油中大量的脂肪酸類成分降低，而通過炒炭方法使其生成大量新的游離脂肪酸，使之含量有明顯的升高。酒炙、烘干(40℃和100℃)能較好地保留脂肪酸類成分。

林蛙油主要成份是蛋白質[12-13]，本文參照2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則 0713脂肪與脂肪油測定法第三法——雙縮脲法進行測定，測得水溶性蛋白含量：未炮制>烘干(40℃)>酒炙>烘干(100℃)>煮制>燉制>清炒>炒炭，不同炮制和加工方法均使水溶性蛋白成分有所降低，其中烘干40℃降低最少，和未炮制林蛙油幾乎相當，可以較好地保護蛋白質類成分。其中高溫炒炭降低最多，說明長時間和高溫加熱會破壞林蛙油中水溶性蛋白成分，故建議低溫炮制和加工，保留林蛙油水溶性蛋白類成分。

綜合來看，烘干(40℃和100℃)、酒炙、燉制、煮制、炒炭和清炒均對林蛙油中總醇提物、脂溶性成分、脂肪酸類化合物和蛋白質類化合物具有一定的影響，其中低溫烘干的加工方式對林蛙油藥效成分的保留有較好作用，而清炒和炒炭對各類成分破壞較大。溫度和受熱時間對林蛙油各類營養物質影響較大，食用和加工林蛙油時，建議控制加熱溫度和時間。