金錢草治療膽囊相關疾病作用機制的網絡藥理學研究

黃彭 曲佳琳 常樂 柯紅文 楊迎 冷愛晶

摘 要 目的：采用網絡藥理學方法探究金錢草治療膽囊相關疾病的作用機制。方法：通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP），以“類藥五原則”和“口服吸收利用度（OB）>30%”為標準篩選金錢草活性成分，預測相關靶點，并利用Cytoscape 3.2.1軟件構建活性成分-靶點網絡；在數據庫TTD、OMIM、PharmGKB、DrugBank和GAD中，以“膽石癥”“膽結石”“膽囊炎”和“膽管炎”為關鍵詞預測相關靶點，構建疾病-靶點網絡，并與活性成分作用靶點融合，獲得治療靶點，使用數據庫DAVID對靶點進行通路富集分析，以靶點與活性成分進行分子對接，以此篩選出金錢草發揮治療作用的主要成分。結果：篩選獲得金錢草中具有類藥性、口服吸收較好的27種成分；通過網絡構建、融合得到金錢草作用靶點33個，通路富集分析得到相關通路7條，主要涉及癌癥通路、ABC轉運體通路等；金錢草活性成分中對接得分排序前4位的分別是山柰酚、金合歡素、橙皮素和異鼠李素，主要作用于ABCC3、ABCB1、ABCC2、ABCB4靶點。結論：金錢草主要通過ABC轉運體通路發揮治療膽囊相關疾病的作用。

關鍵詞 金錢草；膽囊相關疾病；靶點；通路；網絡藥理學；作用機制

Study on Network Pharmacology of the Mechanism of Lysimachia christinae in the Treatment of Cholecyst Related Disease

HUANG Peng1，2，QU Jialin1，CHANG Le3，KE Hongwen4，YANG Ying1，2，LENG Aijing2，5（1.Clinical Laboratory of Integrative Medicine， the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University， Liaoning Dalian 116011， China；2.Institute of Integrative Medicine， Dalian Medical University， Liaoning Dalian 116044， China；3.Jinzhou Institute for Drug Control， Liaoning Jinzhou 121000， China；4.Dept. of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University， Liaoning Dalian 116011， China；5.Dept. of Traditional Chinese Medicine， the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University， Liaoning Dalian 116011， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To explore the mechanism of Lysimachia christinae in the treatment of cholecyst related diseases by network pharmacology. METHODS： The active ingredients of L. christinae were screened through TCMSP database with “Lipinski rule” and “Oral bioavailability >30%” rules， and their related targets were predicated correspondingly， then compound-target network were constructed by Cytoscape 3.2.1 software. Disease related targets were predicted by searching TTD database， OMIM database， PharmGKB database， DrugBank database and GAD database with “cholelithiasis” “gallstones” “cholecystitis” and “cholangitis” as keywords. Then， the network of disease-target was constructed and merged with active ingredient target to obtain therapeutic target. After pathway enrichment analysis of therapeutic target were performed by utilizing the DAVID database， molecular docking between target and active ingredient was also conducted in order to screen the main active ingredients of L. christinae. RESULTS： Twenty-seven active ingredients with good oral absorption and drug-like properties were screened from L. christinae. Thirty-three targets were attained after constructing and merging the network. Seven pathways， mainly related to cancer pathway and ABC transporter pathway were achieved. Top 4 active ingredients of L. christinae in the list of docking score were kaempferin， acacia， hesperetin and isorhamnetin， which acted on ABCC3， ABCB1， ABCC2， ABCB4 target. CONCLUSIONS： L. christinae treat cholecyst related diseases through ABC transporter pathway.

KEYWORDS Lysimachia christinae； Cholecyst related diseases； Target； Pathway； Network pharmacology； Mechanism

金錢草始載于《本草綱目拾遺》，為報春花科植物過路黃（Lysimachia christinae Hance）的干燥全草，其味甘、咸，性微寒，歸肝、膽、腎和膀胱經，具有利濕退黃、利尿通淋和解毒消腫等功效，常用于治療石淋、熱淋、小便澀痛、濕熱黃疸、膽脅脹痛、癰腫疔瘡和蟲蛇咬傷等[1-2]。在我國，中醫藥治療急性和慢性疾病已有數千年的歷史，包括其在膽結石防治中的應用也引起了越來越多的關注。根據對歷代醫家組方規律的分析結果顯示[3]，金錢草在膽結石防治的組方中的用藥頻率居于前列。但是，其作用機制的研究也僅局限于單個蛋白水平，難以體現金錢草多成分、多靶點的作用機制，也難以體現中醫藥整體性的特點。與化學藥不同，單味中藥常包含多種化學成分和多個作用靶點[4]，這也使得對中藥作用機制的系統性研究存在困難。隨著生物信息學、系統生物學和多向藥理學的快速發展，網絡藥理學方法為中醫從經驗醫學向循證醫學的轉化提供了新的研究范式，將極大地促進中醫藥領域的發展[5]。采用網絡藥理學，可以篩選中藥成分之間的協同作用，更好地解釋中藥治療疾病“多成分-多靶點”的作用特點，由此進一步探究“中藥-疾病”之間的關系。本研究旨在篩選金錢草中具有成藥性、口服吸收效果較好的活性成分，預測活性成分與膽囊相關疾病的靶點及信號通路，為金錢草治療膽囊相關疾病的系統性研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 數據庫與軟件

中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）；有機小分子生物活性數據庫PubChem （https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；SwissTargetPrediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）；網絡拓撲屬性分析軟件Cytoscape 3.2.1（http：//www.cytoscape.org）；藥物靶標數據庫（Therapeutic target database，TTD，http：//bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp）；人類孟德爾遺傳數據庫（Online mendelian inheritance in man，OMIM，http：//omim.org/）；藥物遺傳學和藥物基因組學知識庫（Pharmacogenetics and pharmacogenomics knowledge base，PharmGKB，https：//www.pharmgkb.org/）；藥物銀行（DrugBank）數據庫（http：//www.drugbank.ca/）；遺傳關聯數據庫（Genetic association database，GAD，https：//geneticassociationdb.nih.gov/）；基因疾病大集合數據庫（DisGeNET，http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu）；生物學信息注釋數據庫DAVID V6.8 （https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）；Systems Dock 在線分子對接工具（http：//systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/ index）。

1.2 金錢草活性成分的篩選

口服給藥是一種方便、經濟及安全的給藥途徑，由于一些成分在水中的溶解度很低，經口服吸收后效果不理想，因此，本研究通過“類藥五原則”和“口服吸收度（OB）”來篩選金錢草中的可被吸收成分。通過TCMSP[6]，依據“類藥五原則”（本文選擇簡化后的四原則）和 “OB”進行篩選，篩選原則為：相對分子質量（MW）≤500、油水分配系數（AlogP）≤5、氫鍵供體數（Hdon）≤5、氫鍵受體數（Hacc）≤10、OB>30%[7]，由此獲得金錢草中可被口服吸收的活性成分，列出MOL ID編號。

1.3 金錢草活性成分靶點的整理

基于所篩選的成分，從PubChem數據庫獲得成分的InChI Key（一種用來識別化合物的文本）、Canonical SMILES（簡化分子線性輸入規范）和CAS number（物質數字識別號碼）。然后，利用InChI Key或Canonical SMILES從TCMSP獲得成分靶點，再利用Canonical SMILES從SwissTargetPrediction數據庫[8]中獲得成分靶點，將兩個數據庫中的靶點去重復后合并。

1.4 金錢草活性成分-靶點網絡的構建

將篩選所得成分和相關靶點輸入到Cytoscape 3.2.1中構建成分-靶點網絡圖，用以闡明金錢草發揮作用的物質基礎和作用機制。Cytoscape 3.2.1作為一個可視化的網絡工具[9]，在一個網絡圖中，“節點”表示基因、中藥、成分、疾病或疾病的臨床表型，“邊”是一種聯系，節點的“度”是與之相連的邊的數目[5]。度值越大，表明活性成分通過該靶點發揮的治療作用越大。

1.5 膽囊相關疾病靶點的整理及其網絡構建

以“膽石癥”“ 膽結石”“膽囊炎”和“膽管炎”為關鍵詞，依次從以下數據庫中獲得各疾病相關靶點：（1）TTD[10]，（2）OMIM[11]，（3）PharmGKB[12]，（4）DrugBank[13]，（5）GAD[14]，（6）DisGeNET datebase[15]。將上述6個數據庫得到的靶點去重匯總即為各疾病靶點，然后利用Cytoscape 3.2.1構建疾病-靶點網絡圖。

1.6 金錢草成分靶點和膽囊相關疾病靶點的集合

利用Cytoscape 3.2.1中Merged 功能，將成分-靶點和疾病-靶點網絡圖進行合并，選取二者共同作用的靶點，即為金錢草發揮治療作用的靶點。

1.7 京都基因與基因組百科全書通路富集分析

為了進一步闡明金錢草的作用機制，通過生物學信息注釋數據庫DAVID V6.8對作用靶點進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and gnomes，KEGG） 通路富集，設定“Background”為“Homo sapiens”，根據通路富集結果，并以P<0.05作為顯著功能和通路的臨界值，利用Cytoscape 3.2.1進行成分-靶點-通路的網絡構建。

1.8 分子對接和靶點驗證

為了進一步評價靶蛋白與成分之間的相互作用關系，采用Systems Dock 在線分子對接工具，對目的蛋白和化合物分子進行分子對接。首先需下載蛋白的3D結構，輸入蛋白名，上傳蛋白結構文件及化合物結構信息，按照提示步驟操作進行對接，可以得到靶蛋白與化合物分子的對接結果，包括對接得分和柱狀圖等結果。根據分值大小對配體與受體的結合狀態進行判斷分析，得到金錢草發揮治療作用的主要成分。

2 結果

2.1 金錢草活性成分篩選

通過“類藥五原則”和“OB”來篩選金錢草中的可被吸收成分，共獲得27種成分，成分信息見表1。

2.2 金錢草活性成分靶點的預測和成分-靶點網絡的構建

利用TCMSP和Swiss Target Prediction獲得成分靶點，將2個數據庫中的靶點去重后得到296個（例如NFKBIA、CASP9、AHSA1、ABCB1、UGT2B4、ACHE、AKR1E2、CHRNA2等）靶點。

利用Cytoscape3.2.1構建金錢草活性成分-靶點網絡圖，見圖1。

由圖1可見，網絡包括323個節點（27個成分節點，296個靶點節點），構成了851條相互作用關系。在網絡中，靶點PTGS2（前列素內環氧化物合成酶2）、CHRM2（M2-乙酰膽堿能受體基因）、CHRM1（毒蕈堿型膽堿受體M1）、去甲腎上腺素轉運體基因SLC6A2、GABRA1（γ-氨基丁酸A受體α1）、PTGS1（過氧化物合酶1）和成分MOL000098（槲皮素）、MOL000422（山柰酚）、MOL000354（異鼠李素）具有較高的度值，提示這些可能是發揮療效的潛在靶點。同時也體現了金錢草“多成分”和“多靶點”的作用特點。

2.3 金錢草活性成分靶點和膽囊相關疾病靶點的集合

構建的疾病-靶點的網絡圖見圖2。

由圖2可見，4種膽囊相關疾病與258個靶點之間有相互作用。使用Cytoscape 3.2.1 的Merged功能，成分-靶點網絡與疾病-靶點網絡融合，取其交集部分構建活性成分-治療靶點-疾病相互作用網絡圖，得到金錢草中發揮治療作用的靶點33個。活性成分-治療靶點-疾病相互作用網絡圖見圖3。

2.4 KEGG通路富集分析和金錢草活性成分-治療靶點-通路網絡構建

通過DAVID數據庫平臺進行KEGG通路富集分析，以進一步探究金錢草活性成分-治療靶點網絡中33個靶蛋白的作用機制。結果，33個靶點中有20個涉及到7條通路（P<0.05），詳見表2（各靶點中文名略）。

利用Cytoscape 3.2.1將活性成分-治療靶點、疾病-靶點和靶點-通路網絡合并，得到活性成分、治療靶點以及通路之間的關系，見圖4；從圖4網絡中篩去癌癥信號通路和免疫信號通路，重新構建網絡，得到金錢草治療膽囊相關疾病的活性成分-治療靶點-通路-疾病網絡圖，見圖5（由于與膽囊炎相關的度值為0，故在圖中未顯示）。

從圖5可以看出，三磷酸腺苷結合盒B亞家族成員4（ABCB4）度值較大，多數活性成分作用于ABCB4發揮治療作用。

2.5 分子對接和靶點驗證

利用Systems Dock在線分子對接工具，對ABC轉運體通路靶蛋白和活性成分進行分子對接。其中度值較高的4種活性成分與ABC轉運體通路中4種靶蛋白的分子對接得分結果見圖6，表明這4種成分是金錢草發揮治療作用的主要成分。

3 討論

網絡藥理學為多靶點聯合用藥提供了一個新的方向，并且已經成功運用于中藥的機制研究中。如已利用網路藥理學方法，成功地預測了沙棘總黃酮[16]和白術-枳實[17]治療疾病的作用機制。本研究采取網絡藥理學的方法，首先對金錢草中的成分進行篩選，并預測活性成分相關靶點，構建活性成分-靶點網絡圖，然后對膽囊相關疾病靶點進行搜索，構建疾病靶點網絡圖，最后對成分-靶點和疾病-靶點網絡進行融合，篩選共同的交集靶點，構建活性成分-治療靶點-疾病相互作用網絡圖，分析得到金合歡素、橙皮素和異鼠李素具有較強的生理活性。已有文獻報道，金錢草通過抑制草酸鈣晶體生長和調節脂質代謝[18-19]發揮治療膽石癥功效，其活性成分主要包括多糖[20]、槲皮素和山柰酚[21]。通過對交集靶點進行通路富集分析，構建活性成分-治療靶點-通路-疾病網絡圖，對靶點、通路相關網絡進一步篩選，得到金錢草活性成分通過ABC 轉運體通路發揮治療膽石癥的作用，參與到其中的基因有ABCC3、ABCB1、ABCC2和ABCB4。作為膽固醇的主要載體和溶劑，磷脂對膽鹽誘導的膽道黏膜損傷有保護作用[19]。ABCB4基因編碼的蛋白是一種磷脂酰膽堿易位酶，可將磷脂從小管膜的脂質雙層的內葉轉運到外葉，維護膽固醇代謝的平衡和穩定[22-24]。ABCB4的突變可導致膽汁淤積，其特點是膽汁卵磷脂排出量降低，混合膠束的形成受損，以及產生具有強力親水性膽汁，導致膽小管膜損傷[25-27]。所以，ABCB4 基因及其編碼的蛋白在膽汁及脂類轉運中起到重要作用。此外，ABCB4也對膽管炎有治療作用[28]，因此，ABCB4也被認為是金錢草發揮作用的一個關鍵靶點。

探究中藥的作用機制是一個復雜的過程，涉及到多成分、多靶點。本研究將“類藥五原則”和OB>30%作為篩選金錢草活性成分的原則，得到27種活性成分，結合靶點、通路分析發現，金錢草主要通過ABC轉運體發揮治療膽囊相關疾病的作用。

本研究首次運用網絡藥理方法闡明金錢草治療膽囊相關疾病的作用機制，成功分析出金錢草多成分、多靶點作用特點，但是，研究結果仍需要通過進一步的實驗加以證實。

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（收稿日期：2018-11-12 修回日期：2018-12-27）

（編輯：劉 萍）