綠色熒光蛋白的性質(zhì)和應(yīng)用

◆摘 要：綠色熒光蛋白是一種生物發(fā)光蛋白，它使我們?cè)诓桓蓴_活細(xì)胞功能的情況下，能直接觀察蛋白分子的變化，是一種極具應(yīng)用潛力的標(biāo)記物。我們就綠色熒光蛋白的性質(zhì)、熒光特性、應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)和應(yīng)用進(jìn)行了論述。

◆關(guān)鍵詞：綠色熒光蛋白；性質(zhì)；應(yīng)用

綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）是一種生物發(fā)光蛋白，它主要存在于腔腸動(dòng)物體內(nèi)。1962年，Shimomura等從多管水母（Aequoria victoria）中分離出一種分子量為20kD的生物蛋白，由于水母整體熒光及提取的蛋白質(zhì)顆粒熒光都呈綠色，因此，人們將這種蛋白命名為綠色熒光蛋白。

1綠色熒光蛋白的熒光特性

綠色熒光蛋白的發(fā)光機(jī)制是蛋白在表達(dá)后發(fā)生折疊環(huán)化，形成發(fā)色團(tuán)。綠色熒光蛋白基因表達(dá)后，在觀察到綠色熒光之前，一般有幾小時(shí)的延遲期。在未分離到綠色熒光蛋白的基因之前，人們認(rèn)為綠色熒光蛋白的熒光必須依賴于水母細(xì)胞的其它成分。但是，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，將綠色熒光蛋白cDNA接在T7啟動(dòng)子下在大腸桿菌中表達(dá)，在不加任何外源底物的情況下，紫外光激發(fā)就能觀察到綠光，這說(shuō)明綠色熒光蛋白不需要任何水母細(xì)胞中的有關(guān)物質(zhì)或外加底物，就能在原核和真核細(xì)胞中發(fā)光。

2綠色熒光蛋白的應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)

2.1易于檢測(cè)，靈敏度高

綠色熒光蛋白的熒光反應(yīng)只需紫外光或藍(lán)光激發(fā)即可，不需要外加底物和輔助因子，在顯微鏡下甚至肉眼就能觀察到綠色熒光。其次，綠色熒光蛋白即使未經(jīng)純化，其發(fā)射的綠光也是相當(dāng)強(qiáng)的，在正常室內(nèi)光線下即可辨別。此外，單細(xì)胞水平的綠色熒光表達(dá)也可被識(shí)別。

2.2對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害

目前的研究表明，綠色熒光蛋白對(duì)生活的細(xì)胞基本無(wú)毒害。綠色熒光蛋白基因與目的基因融合后，對(duì)目的基因的結(jié)構(gòu)和功能沒(méi)有影響，經(jīng)其轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞仍可連續(xù)傳代。

2.3可直接用于活細(xì)胞測(cè)定

綠色熒光蛋白能在異源細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而且它的分子量較小，N-端和C-端都能進(jìn)行蛋白的融合，因此它是理想的標(biāo)記物，可進(jìn)行活細(xì)胞實(shí)時(shí)定位觀察。如在活細(xì)胞中直接觀察蛋白向細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，還可實(shí)時(shí)觀察在外界信號(hào)的刺激下目的蛋白的變化過(guò)程。

3綠色熒光蛋白的應(yīng)用

3.1新型的報(bào)告基因

綠色熒光蛋白作為報(bào)告基因，廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中。無(wú)需添加任何底物，通過(guò)熒光顯微鏡就能顯示目的基因在動(dòng)物中的表達(dá)情況。由于綠色熒光蛋白能自發(fā)熒光，且能耐受甲醛的處理，因此在對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物組織進(jìn)行切片時(shí)，只需觀察綠色熒光蛋白的熒光分布即可知道目的基因在組織中的表達(dá)情況。如雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子連接綠色熒光蛋白cDNA在轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)，肌肉、胰腺、腎和心臟均可觀察到綠色熒光。

3.2發(fā)育分子機(jī)理研究

發(fā)育過(guò)程在細(xì)胞水平上看是細(xì)胞生長(zhǎng)分化的結(jié)果，從分子水平上看是基因在不同時(shí)間和空間選擇性表達(dá)的結(jié)果。綠色熒光蛋白可以作為活體標(biāo)記，在原位觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)。這對(duì)線蟲、斑馬魚等透明的動(dòng)物來(lái)說(shuō)，無(wú)疑是非常有效的。綠色熒光蛋白可在特定的神經(jīng)元中表達(dá)，這在線蟲發(fā)育過(guò)程中可以非常方便的檢測(cè)到。未來(lái)綠色熒光蛋白將成為解開(kāi)生物發(fā)育分子機(jī)制之謎的一把有效鑰匙。

3.3用于臨床檢驗(yàn)

綠色熒光蛋白標(biāo)記的抗原或抗體將取代傳統(tǒng)的免疫學(xué)標(biāo)記，綠色熒光蛋白標(biāo)記將成為一種簡(jiǎn)便、快速的免疫診斷新技術(shù)。它與一般的標(biāo)記物相比，有如下優(yōu)點(diǎn)：①對(duì)光穩(wěn)定；②對(duì)抗原或抗體的標(biāo)記效率為100%；③由于是直接的抗原抗體反應(yīng)，不需要再加任何底物，因而方便、快速，且沒(méi)有背景的干擾。

4小結(jié)

綠色熒光蛋白的出現(xiàn)，使我們?cè)诓桓蓴_活細(xì)胞功能的情況下，能直接觀察蛋白分子的變化，結(jié)果可靠，操作簡(jiǎn)單、方便，費(fèi)用低廉。綠色熒光蛋白作為活細(xì)胞的分子探針，今后將廣泛用于對(duì)基因表達(dá)調(diào)控、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、蛋白定位、運(yùn)動(dòng)變化、大分子之間的相互作用等各個(gè)方面的研究。

參考文獻(xiàn)

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作者簡(jiǎn)介

秦永亭（1984—），男，山東濰坊人，碩士，講師，江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院教師，主要從事解剖、生理教學(xué)和神經(jīng)電生理的研究工作。