重組納豆激酶的研究進展

趙福永 嚴寒 任廣旭 高夢祥 劉虹 王靖

摘?要：納豆激酶是一種堿性絲氨酸蛋白酶，具有較強的直接溶解血纖維蛋白的特性，與當前的溶栓藥物相比具有諸多優點，已成為新型溶栓藥物開發的焦點。本文首先簡要介紹了納豆激酶基因及納豆激酶分子的理化特性和生物學功能，對當前國內外采用基因工程技術（密碼子優化、點突變、高效表達系統構建等）重組表達納豆激酶的研究進展進行了綜述，分析了其中存在的主要問題和不足以及商業化生產重組納豆激酶的可能性，對納豆激酶在醫藥、食品等行業中的應用前景進行了展望。

關鍵詞：納豆激酶;溶栓作用;重組表達策略;應用前景

納豆激酶（Nattokinase，NK）最早由日本學者須見洋行在大豆發酵產品納豆中發現并命名[1]。NK主要是由納豆發酵菌納豆桿菌代謝產生的一種絲氨酸蛋白酶，具有較強的纖維蛋白溶解特性，能溶解血栓。相較于目前臨床上常用的溶栓藥物尿激酶、鏈激酶和組織型纖溶酶原激活劑，NK制劑具有安全、高效、可口服、易吸收、價格低和纖溶活力強等優勢，現已成為新型溶栓藥物開發的焦點。此外，NK還被發現具有降膽固醇、降血脂、降血壓、抗菌和抗氧化等多方面的保健作用[2-5]。近年來，國內外學者在NK高產菌種選育、發酵工藝優化、高效分離與純化技術、酶活測定、溶栓機理及產品開發與應用等方面進行了廣泛的研究，取得了一批顯著的成果。傳統NK的生產方法主要是從發酵納豆中進行提取，由于野生型納豆桿菌的胞外分泌型蛋白過多，導致NK分離純化困難，且產量和酶活偏低，不利于NK的產業化發展和市場需求。隨著現代分子生物學技術的迅速發展，NK重組表達技術也日趨成熟和完善，本文對NK的重組表達研究進展進行了綜述。

1?NK基因及其編碼蛋白特性

1992年，Nadamura 等[1]首次從納豆桿菌中克隆獲得了NK基因（aprN）全長序列。其編碼多肽鏈長381氨基酸（AA），其中N端29 AA為信號肽，其后的77 AA為具有分子伴侶作用的前導肽，成熟肽長275 AA，是一種單鏈多肽酶。該酶是一種堿性絲氨酸蛋白酶，其N末端為丙氨酸，相對分子質量約為27.7 kDa。截止2018年11月，作者從NCBI網站共搜索到12條NK基因全長序列。對附表中NK基因核苷酸序列比對發現，序列KF734090、FJ376817和FJ407060均為1 089 bp，缺失信號肽區的57 bp，其余均為1 046 bp，序列間核苷酸一致性在97%～100%之間。對成熟肽序列比對發現，所有成熟肽長度均為275 AA，且位于活性中心的Asp32、His64和Ser221及結合中心的Ser125、Leu126和Gly127相同，說明不同菌株來源的NK功能極為保守。NK的等電點為8.6，最適pH值為8.0，最適溫度為45℃，多次凍融對酶活影響不大，且分子內無二硫鍵[6]。但是，酶活易受金屬離子影響，Hg2+和Cu2+對酶活具有明顯抑制作用，而Ca2+、Mn2+、Fe2+則對酶活有明顯的激活作用。此外，乙二胺四乙酸（EDTA）對NK有輕微的抑制作用，而蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）對NK有明顯的抑制作用，可使酶活完全喪失[6]（附表）。

2?NK的溶栓功能、機理及保健功效

NK氨基酸序列與枯草桿菌蛋白酶E、DFE和QK-2等具有很高的同源性和結構相似性，同屬絲氨酸蛋白酶家族，但只有NK對血纖維蛋白具有水解作用，且表現出極高的底物特異性[1，7]。因此，NK是一種良好的血栓溶解藥物，其溶栓作用主要通過4條途徑實現：（1）直接水解纖維蛋白。NK不能直接水解血漿纖維蛋白原，但可以水解交聯后的纖維蛋白，將其降解為可溶性產物，從而溶解血栓。（2）刺激血管內皮細胞產生t-PA。t-PA在體內纖溶系統中起著重要作用，它可激活體內的組織纖溶酶原形成纖溶酶，進而溶解纖維蛋白。（3）激活尿激酶原轉化為尿激酶。NK可將體內的尿激酶原激活轉化為尿激酶，從而使內源性纖溶酶的量和活性間接增強。（4）降解和失活t-PA和尿激酶的抑制劑 pAI-1[8]。此外，NK還具有預防血栓形成、抑制血小板凝集、預防高血壓、改善血流與微循環等保健功效[2-5，9]。

3?重組NK的高效表達策略、技術及主要問題

基因工程領域常采用密碼子優化、選擇強啟動子或特異啟動子、增刪表達調控元件（增強子、信號肽、內含子、Kozak 序列等）、分泌表達、融合表達等策略與技術，以實現目的基因的高水平轉錄和高效翻譯，并結合適宜的表達系統及發酵工藝最大量提高目的蛋白的表達水平。NK基因的成功克隆，為利用基因工程技術產業化生產重組NK奠定了基礎。

3.1?密碼子與表達調控元件優化提高表達量與酶活

韓嵐等[10-12]和劉靚蕾等[13]通過密碼子優化設計并人工合成了含和不含內含子的2種NK基因。對番茄果實、煙草和甜瓜瞬時轉化結果表明，在番茄果實特異啟動子E8調控下的NK表達量明顯高于組成型啟動子35S調控下的表達量;同時，有內含子的NK的表達量明顯高于無內含子的表達量，且纖溶酶活性也較高。劉朔[14]對NK成熟肽編碼區進行密碼子優化后，用分泌表達策略在畢赤酵母中進行表達，表達量相較優化前提高了3.5倍，活性達512 IU/mL。葛春蕾等[15]通過串聯3個PHpaII啟動子調控NK基因在枯草芽孢桿菌WB800中進行高效分泌表達，NK產量最高達 213.30 FU/mL，相比單個啟動子 PHpaII提高了92.51%。何孝天[16]比較3種不同信號肽（wapA、yncM、pre）對NK分泌表達的影響發現，wapA介導的NK在枯草芽孢桿菌中的表達量明顯高于原信號肽pre，且酶活也較高，達1 052 FU/mg。Liang等[17]利用協助胞外表達的啟動子pel B，實現了NK在大腸桿菌的胞外可溶性表達，但表達量偏低。Chiang等[18]將NK與油脂蛋白融合表達，通過表達蛋白在含有甘油三酯和磷脂等成分的人工油體中復性，獲得了有活性的蛋白。Wu等[19]通過優化啟動子，在枯草芽孢桿菌中使NK的表達量增加了136%，酶活達1 999U/mL。

3.2?點突變提高熱穩定性、酶活和pH值耐受性

對NK熱穩定性和pH值耐受性的改善，將有助于在工藝生產環節中保證酶活，并延長其在機體內的作用時間。趙菡等[20]采用點突變技術獲得了酶活提高的NK突變體Q59E及熱穩定性提高的突變體N218D，且雙突變體Q59E/N218D的熱穩定性進一步提高，使半衰期延長了約2.75倍，而酶活與野生型酶相當。P14L和N76D突變體則可使65℃下的半衰期由20min分別延長至30min和50min[21]。D36G突變體可使熱穩定性提高20%，比活力提高16.6%[22]。L31I突變體的催化效率是野生型酶的2倍，雙突變M222A/I31L和T220S/I31L的酶活明顯高于單突變，且M222A/I31L的氧化穩定性也高于野生型酶。Wu等[23]證實，若NK第100位氨基酸為體積大的或帶正電荷的側鏈，則其底物結合和催化活性會大幅度下降，而若第101位為此類氨基酸則其酶活明顯提高;第126位的任意突變均會破壞活性中心的結構，從而使酶活大幅度下降。Zheng等[24]對NK分子三維結構模型分析發現，Ser33、Asp60、Ser62和Thr220之間形成的氫鍵對穩定水解反應的過渡態至關重要，任一位點的突變導致氫鍵的移除均會增加過度態的自由能，從而降低NK對底物的催化效率。周波[25]對Ser182和Leu203位點的點突變性質研究發現，NK重組酶的最適pH值的變化與氨基酸替換呈現出相關性：酸性氨基酸有利于酶在酸性范圍內穩定，而堿性氨基酸有利于酶在堿性范圍內穩定。此外，DNA shuffling人工分子進化技術對于目的基因分子改性具有積極作用。Cai等[26]建立了納豆芽孢桿菌AS 1.107、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）CICC 20164和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）CICC 10092三個菌株的NK同源基因的突變子庫，篩選到催化效率比野生型提高2.3倍的NK突變體。

3.3?NK重組表達系統

NK已在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、乳酸乳球菌、畢赤酵母和昆蟲細胞等表達系統中實現了表達，以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和畢赤酵母報道較多。在大腸桿菌（BL21）表達系統中，NK酶原基因可表達出有活性的蛋白產物，表達量要明顯高于枯草芽孢桿菌表達系統，但活性相對偏低[27]，且缺乏信號肽和前導肽序列的NK基因表達產物易形成包涵體，常規方法很難使其體外復性[28-29]。張淑梅等[30]在大腸桿菌（DH5α）中表達的NK蛋白占菌體蛋白的21.5%，其1 mg干粉的溶栓活性相當于2 000 U尿激酶。童煜[31]獲得的重組NK蛋白占菌體蛋白的36%，但1 mg干粉的溶栓活性僅相當于600 U尿激酶。郭文秀[32]對大腸桿菌HB101和BL21表達NK比較研究發現，前者表達量約占菌體蛋白的25%，后者略高，為31%。枯草芽孢桿菌是NK的天然表達菌種，可實現可溶性表達。Chen等[33]通過發酵條件優化，用搖床培養和發酵罐培養表達NK，使酶活分別達到了71 500 CU/mL和77 400 CU/mL。Cui等[34]采取信號肽、啟動子、順式調控元件逐步優化策略，發現去除了5UTR端CodY結合序列的啟動子P08和信號肽SPwapA組合，以胞外酶缺失型枯草芽孢桿菌菌株WB800作為表達宿主菌，可使NK的分泌表達水平達292 FU/mL。Wei等[35]應用基因敲除技術構建了地衣芽孢桿菌胞外酶缺失型基因工程表達菌株BL10，并結合信號肽優化，實現了NK的高水平穩定表達。相較于優化前，發酵活性最高可達33.83 FU/mL，提高了229%。若對BL10的全合成培養基進行優化，NK的純度和比活力還可進一步提高[36]。敬俊鋒等[37]在畢赤酵母X33中表達825 bp的NK成熟肽基因，每毫升培養物活性相當于195 U尿激酶。閆少華[38]對NK在畢赤酵母中重組表達的大規模發酵培養條件進行了探索。Liang等[39]采用分泌表達策略在食品級菌種乳酸乳球菌中成功表達了NK，每毫升培養物活性相當于41.7 U尿激酶。研究結果為重組NK的直接口服應用研究提供了新思路。此外，NK在昆蟲細胞[40]和病毒[41]中也實現了有活性表達。

不同的表達系統因自身的特性各有優缺點。從上述NK的表達結果來看，大腸桿菌表達系統的表達量相對較高，且易于純化，但表達產物無活性或活性極低，主要以包涵體形式存在，需要通過后續復性才能獲得有功能的酶;枯草芽孢桿菌作為NK產生的天然菌種，其表達活性最好，但是胞外分泌型雜蛋白多，純化難度大;畢赤酵母表達系統的純度高，但存在活性低，表達量相對較小的缺點。

要實現NK的高效重組表達，筆者認為可以從以下幾個方面著手，逐步實現。首先，在對NK蛋白分子結構和特性認識的基礎上，采用點突變或DNA shuffling技術等獲得能在表達宿主菌或細胞中高效轉錄和翻譯的突變基因;其次，將NK的前導肽和成熟肽基因同時表達。NK的前導肽是一種分子內分子伴侶，在NK的正確折疊過程中發揮著重要作用。大腸桿菌中和畢赤酵母中表達無前導肽的蛋白的活性要遠低于有前導肽的[42-43]。第三，優化表達調控元件，構建高效表達載體。如選用強啟動子或特異啟動子、選擇合適的信號肽、添加內含子或增強子、加裝Kozak序列、去除CodY等負調控元件等。第四，選用蛋白酶缺失型宿主細胞，采用融合表達或分泌表達策略。宿主細胞蛋白酶缺失可以極大地降低對目的蛋白的水解風險，從而提高目的蛋白的表達量。如胞外蛋白酶缺失型枯草芽孢桿菌基因工程菌株WB400、WB600、WB800以及地衣芽孢桿菌基因工程表達菌株BL10等。高產、高活性重組表達產品的獲得，既涉及上游的基因優化、表達載體構建以及表達系統的選擇，也涉及下游的發酵條件優化、分離純化技術等，應同時加以綜合考慮。

4?NK重組表達產品的應用與開發前景

隨著對NK研究的不斷深入，NK產業展現出了巨大的商業價值和廣闊的應用前景。首先，NK作為輔助溶栓的保健品藥物，現已在發達國家廣泛使用。日本是NK產品的最大生產國家，市售產品名類眾多，如日研納豆激酶膠囊、ASTALIVE納豆激酶等。日本生物科學研究所已推出了第四代納豆激酶制品（3 000FU）。美國市面上也有多種NK產品銷售，我國納豆激酶制劑-恩開膠囊已進入生產工藝中試階段。其次，NK作為一種堿性絲氨酸蛋白酶，可作為脫毛劑用于皮革行業。與傳統皮革脫毛方法相比，酶法脫毛不僅可以保護和軟化皮革，改良產品的柔軟度、可著色度、潔白度等，還環保高效。第三，NK可作為添加劑用于洗滌行業。有研究表明，NK是一種有機溶劑耐受性蛋白酶，對洗滌劑有極強的耐受性[44-45]。因此，可通過NK將一些大分子蛋白類污漬酶解成易溶于水的小分子片段，達到快速去污的目的。第四，可作為飼料添加劑，用以改善飼料的營養價值和利用率。NK作為一種蛋白酶，能將高蛋白含量的豆粕、玉米等飼料中大分子蛋白質降解為小分子多肽，從而提高其利用率，降低養殖成本，實現增收。第五，利用轉基因技術，實現NK的生物反應器表達，開發功能性食品。如在番茄、甜瓜、生菜等生食類瓜果和蔬菜中或食品級乳酸菌中高表達NK，人類可直接吸收和利用NK，無需分離與純化等步驟，既降低了生產成本，還可達到藥食兩用的目的。

5?結論

NK具有廣闊的開發前景。采用基因工程技術制備重組NK，不僅具有分離純化方便、產量高、活性高等優勢，還具有安全可靠、生產成本低廉等經濟效益和社會效益。相信不久的將來，NK將在醫藥、食品、養殖、化工等行業和領域形成新的產業。

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Research Advancement on Recombinant Nattokinase

ZHAO Fu-yong1，YAN Han1，REN Guang-xu2，GAO Meng-xiang1，LIU Hong3，WANG Jing2

（1College of Life Science，Yangtze University，Jingzhou 434025，China;2Institute of Food and Nutrition Development，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Beijing 100081，China;3 College of Life Science，South-central University for Nationalities，Wuhan 430074，China）

Abstract：Nattokinase is a kind of alkaline serine protease with a strong and direct fibrinolytic activity，has been the focus of development of new antithrombotic agent to prevent cardiovascular disease because of its advantages over conventional drugs in recent decade.The gene cloning，physicochemical properties and biological function of nattokinase were first introduced briefly，then the main studies and progress of recombinant expression of nattokinase by genetic engineering technology including codon optimization，point mutation，efficient expression system and so on were summarized，meanwhile some technical bottlenecks and obstacles to nattokinase industrial production were analyzed.Finally，the application prospect of nattokinase in medicine，food and other industries in the near future was discussed.

Keywords：nattokinase;fibrinolytic activity;recombinant expression strategy;application prospect

（責任編輯?唐建敏）