鹽處理對(duì)兩種甘草幼苗的抗氧化系統(tǒng)及總黃酮含量的影響

馬紅 方龍寶 馬海麗 趙鳳香 柴薇薇

摘要：研究目的：甘草是一種適生于荒漠鹽漬化地區(qū)的豆科藥用植物，但不同品種甘草對(duì)鹽的適應(yīng)性不同，本研究通過比較烏拉爾甘草、黃甘草在不同濃度NaCl處理下抗氧化酶活性及抗氧化物質(zhì)黃酮含量的差異，初步分析了兩種甘草抗氧化系統(tǒng)酶及抗氧物質(zhì)在鹽處理下的變化特征。結(jié)果表明：兩種甘草均可以通過提高抗氧化酶活性和積累抗氧化物質(zhì)黃酮來適應(yīng)鹽處理，在50 mmol/L NaCl處理下，兩種甘草中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性在地上和地下呈現(xiàn)出差異，烏拉爾甘草黃酮積累高于黃甘草;在200 mmol/ L NaCl處理下，烏拉爾甘草葉中SOD、POD活性、總黃酮含量均顯著高于黃甘草（P<0.05），初步推測(cè)烏拉爾甘草在高鹽條件下具有更好的抗氧化能力，并能夠更好的積累藥用活性物質(zhì)黃酮，因此更適于在鹽漬化地區(qū)推廣種植。

關(guān)鍵詞 鹽處理;烏拉爾甘草;黃甘草;SOD;POD;黃酮

中圖分類號(hào)： S567.23??? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

隨著干旱的頻繁發(fā)生及化肥的使用和灌溉農(nóng)業(yè)的發(fā)展，土壤的次生鹽漬化程度日趨嚴(yán)重，已經(jīng)成為限制植物栽培的重要因素之一。鹽脅迫會(huì)引起植物細(xì)胞的離子脅迫和滲透脅迫，進(jìn)而導(dǎo)致活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的過量積累。但是植物通過長(zhǎng)期的進(jìn)化，形成了復(fù)雜的抗氧化防御機(jī)制，包括酶途徑和非酶途徑，來消除過量的活性氧積累。酶途徑保護(hù)機(jī)制中主要有超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）等，其中SOD可以清除超氧陰離子的超氧化物歧化酶活性增加并產(chǎn)生過氧化氫等物質(zhì)，POD可以催化過氧化氫氧化產(chǎn)生水，來降低膜內(nèi)不飽和脂肪酸的過氧化程度。非酶途徑中直接參與活性氧（ROS）清除的抗氧化物有黃酮、多糖、谷胱甘肽等，這些物質(zhì)既可以直接同ROS反應(yīng)，將其還原，又可作為酶的底物在ROS的清除中發(fā)揮重要作用。

甘草為豆科多年生藥用草本植物，主要品種有烏拉爾甘草 （ Fisch.）、光果甘草（ L）、脹果甘草（Batal.）及黃甘草 Peng.）等，其烏拉爾甘草、黃甘草廣泛分布于新疆、甘肅、內(nèi)蒙古等干旱、半干旱鹽漬地區(qū)，是一種防風(fēng)固沙耐鹽堿植物。研究不同品種甘草在鹽處理?xiàng)l件下抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng)，可以為甘草在鹽漬化地區(qū)的栽培提供理論基礎(chǔ)。已經(jīng)有研究表明超過200 mmol/L? NaCl對(duì)甘草造成脅迫，其體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，因此本研究選擇了低于200 mmol/L的NaCl對(duì)烏拉爾甘草和黃甘草進(jìn)行鹽處理。由于甘草中蘊(yùn)藏著大量的抗氧化物質(zhì)，如黃酮等，其具有抑菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理作用，但在不同品種、不同產(chǎn)地甘草中的含量差異較大。因此對(duì)甘草不產(chǎn)生脅迫的情況下，進(jìn)行適度的鹽處理，將甘草抗氧化酶、甘草黃酮與鹽脅迫相關(guān)聯(lián)，比較不同品種甘草中抗氧化酶活性及抗氧化黃酮的變化特征，可以為鹽堿條件下開發(fā)利用甘草提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用材料烏拉爾甘草、黃甘草種子購(gòu)買于甘肅酒泉，挑選飽滿充實(shí)、大小均勻、色澤飽滿的甘草種子，用98%濃硫酸消毒并進(jìn)行催芽，放置在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待幼苗長(zhǎng)出2-3片真葉后移入穴盤中，采用蛭石培養(yǎng)，每周用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌3次，在室溫中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 鹽處理

當(dāng)出苗5周左右時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的材料，以Hoagland營(yíng)養(yǎng)液為對(duì)照（CK），選擇對(duì)甘草并不造成脅迫傷害的鹽濃度進(jìn)行鹽處理。Hoagland營(yíng)養(yǎng)液分別添加50 mmol/L ?NaCl和200 mmol/L NaCl進(jìn)行處理，每2 d更換處理液，分別于處理第7 d、14 d取樣，進(jìn)行酶活性指標(biāo)測(cè)定，處理第60 d取樣，進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定，每處理設(shè)4次重復(fù)。

1.3 酶提取液的制備

分別準(zhǔn)確稱取約0.1g根和葉，加入1ml提取液進(jìn)行冰浴勻漿，8000 g 4℃離心10min，取上清液，置冰上待測(cè)，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明書操作，SOD（SOD-2-Y，蘇州科銘）、POD（POD-2-Y，蘇州科銘）。

1.4 超聲波法提取甘草總黃酮

用50 mmoL/L、200 mmoL/L ?NaCl分別處理60 d后，取葉和根清洗干凈，在105℃下烘干，粉碎，過100目的篩，然后精確稱取葉、根各1.0 g，倒入錐形瓶中，料液比1：20，80%乙醇，超聲提取20 min，功率150 W，過濾、共提取2次，合并濾液，最后定容。

取適量提取液于10mL 容量瓶中，加水5mL，振蕩片刻，加5%亞硝酸鈉溶液0. 5mL，搖勻、放置 6min后加10%的硝酸鋁溶液0. 5mL，搖勻放置6min后加5%的氫氧化鈉溶液2. 5mL，放置15 min 后蒸餾水定容至10mL，試劑為空白，于510nm 處測(cè)吸光度值A(chǔ)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算出黃酮含量。

計(jì)算公式為：C（%）= （V*X）/（100*A*W）*100%

其中： X—比色液中黃酮含量（ mg/mL） V—提取液體積（ mL）; A—取樣體積（ mL）; W—甘草重量（g）

1.5 黃酮含量的測(cè)定方法

（1）紫外分光光度法：用蘆丁代替黃酮做對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，采用亞硝酸鈉 -硝酸鋁比色法，在510nm處測(cè)定甘草中總黃酮含量。

（2）工作曲線回歸方程：精確稱取在 105 ℃干燥恒重的蘆丁對(duì)照品10mg，用95 %的乙醇溶解，搖勻，定容至10mL，配置成為濃度1mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，作為貯備液備用。精密量取上述溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 ml，分別加水3 ml，加5%的亞硝酸鈉溶液0.5 ml，放置6 min，加10%的硝酸鋁0.5 ml，搖勻，放置6min，加入5%的氫氧化鈉溶液2.5 ml，混勻，放置15 min后蒸餾水定容10 ml，用紫外分光光度計(jì)法在波長(zhǎng)510nm 處測(cè)吸光度。

將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行一元線性回歸，得蘆丁濃度（X）-吸光度（A）方程：X =（A+0.0289）/0.1889相關(guān)系數(shù) R=0.9937。

1.6 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)采用 Excel 2010軟件，SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，平均值比較采用 LSD 0.05標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SOD活性的變化

SOD是保護(hù)植物細(xì)胞免受自由基傷害的第1道防線，它是防御活性氧的關(guān)鍵酶。在50 mmol/L NaCl處理下，烏拉爾甘草和黃甘草中SOD活性均隨鹽處理的時(shí)間增長(zhǎng)呈現(xiàn)不斷升高的趨勢(shì)。葉中，兩種甘草SOD活性顯著高于CK（P<0.05），處理14 d時(shí)，烏拉爾葉中SOD活性顯著高于黃甘草（P<0.05）（圖1 A）;在根中，兩種甘草SOD活性在處理7d、14d時(shí)均顯著高于CK（P<0.05），在處理14 d時(shí)，黃甘草SOD活性顯著高于烏拉爾甘草（P<0.05）（圖1 B）。

在200 mmol/L NaCl處理下，兩種甘草中SOD活性總體上都隨著鹽處理時(shí)間增加而呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。在葉中，兩甘草SOD活性顯著高于CK，處理14d時(shí)，烏拉爾SOD活性顯著高于黃甘草（P<0.05）（圖2 A）;在根中，當(dāng)200 mmol/L NaCl 處理7d 時(shí)，兩種甘草SOD活性均顯著高于CK，繼續(xù)處理到14 d時(shí)，兩種甘草根中的SOD活性差異不顯著（P<0.05）（圖2 B）。

2.2 POD活性的變化

在50 mmol/L NaCl處理下，兩種甘草葉中POD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)（圖3 A），但黃甘草葉中的POD活性顯著高于烏拉爾甘草（P<0.05）（圖3 A）;根中烏拉爾甘草POD活性卻呈現(xiàn)出始終上升的趨勢(shì)，而黃甘草中的POD活性卻先增高后下降，處理14d時(shí)，烏拉爾POD活性顯著高于黃甘草（P<0.05）（圖3 B）。

在200 mmol/L? NaCl下，烏拉爾甘草葉中POD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，而在黃甘草中隨著鹽處理時(shí)間逐漸上升，在處理7 d、14 d時(shí)，烏拉爾葉中POD活性顯著高于黃甘草（P<0.05） （圖 4 A）;在根中，兩種甘草根中POD活性隨著鹽處理的時(shí)間呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，烏拉爾甘草POD活性始終高于黃甘草（P<0.05）（圖 4 B）。

2.3 黃酮含量的變化

在葉中，兩種甘草總黃酮含量呈現(xiàn)不同的變化，烏拉爾甘草總黃酮含量隨著鹽濃度增強(qiáng)而呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，而黃甘草總黃酮含量隨著鹽濃度增強(qiáng)逐漸下降。在200 mmol/L處理下，烏拉爾葉中總黃酮含量達(dá)1.30%，根中高達(dá)1.01%，無論是根還是葉中，烏拉爾總黃酮含量均顯著高于黃甘草（P<0.05）。說明一定的鹽處理促進(jìn)了烏拉爾甘草黃酮含量的積累，但是較高濃度的鹽處理卻抑制了黃甘草黃酮的合成與積累（表1）。

3 討論

本研究表明，兩種甘草中SOD活性隨鹽處理強(qiáng)度增大而增大，而POD活性隨著鹽處理濃度強(qiáng)度先上升再下降，這與萬春陽等的研究一致，表明在一定的鹽處理下，甘草體內(nèi)積累了活性氧，SOD活性增強(qiáng)能有效地清除氧自由基，阻止膜的破壞及過氧化，實(shí)現(xiàn)自我調(diào)節(jié)抵御，POD能夠及時(shí)清除HO，使HO在體內(nèi)含量維持在較低水平，正是由于以上這些保護(hù)酶在鹽處理下增強(qiáng)，維持較高的水平，才使得甘草保持一定的耐鹽性。本研究中低濃度的鹽處理下（50 mmol/L NaCl），兩種甘草均通過保護(hù)酶活性升高來提高自身的防御性，有效地清除氧自由基、降低膜脂過氧化水平，從而減輕膜傷害程度;而在較高濃度的鹽處理下（200 mmol/L NaCl），黃甘草體內(nèi)酶系統(tǒng)的穩(wěn)定性被破環(huán)，因此POD保護(hù)酶的活性不能維持較高水平，出現(xiàn)下降趨勢(shì)，而烏拉爾甘草卻能夠在200 mmol/L NaCl處理下始終保持高的POD活性，且在根中POD活性顯著高于黃甘草，根中合成POD的能力優(yōu)于黃甘草，說明烏拉爾甘草有較強(qiáng)的清除HO的能力。

研究表明，黃酮類化合物是具有抗氧化性和促氧化性兩種性質(zhì)的天然活性因子。 Yao等用CCl誘導(dǎo)肝損傷模型進(jìn)行有機(jī)體實(shí)驗(yàn)，證明黃酮具有抗氧化性，鄭學(xué)欽等也證實(shí)了黃酮具有清除活性氧的作用。本實(shí)驗(yàn)中，烏拉爾甘草總黃酮含量隨著NaCl濃度的增加而升高，而黃甘草中出現(xiàn)了相反的特征，說明在適度鹽處理下，烏拉爾甘草相較于黃甘草能更多的積累黃酮。這與萬世杰等的研究相似，其研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的NaCl脅迫可以提高脹果甘草子葉愈傷組織的甘草黃酮含量。因此，我們推測(cè)鹽漬環(huán)境對(duì)烏拉爾甘草總黃酮含量的積累能起到一定的促進(jìn)作用，但對(duì)黃甘草總黃酮含量積累起到抑制作用。

本研究從抗氧化酶及抗氧化物質(zhì)總黃酮的變化特征揭示了兩種甘草對(duì)鹽的適應(yīng)性，可以為兩種甘草在鹽漬化地區(qū)的推廣種植及開發(fā)利用提供一定的參考依據(jù)。根據(jù)本研究，我們初步認(rèn)為烏拉爾甘草更適合在鹽漬化地區(qū)推廣種植，且適度的鹽有利于烏拉爾甘草中的有效活性成分黃酮的開發(fā)利用。未來對(duì)于甘草在鹽漬條件下的開發(fā)利用，還需進(jìn)行更加深入的研究。

參考文獻(xiàn)

[1]胡濤，張鴿香，鄭福超.植物鹽脅迫響應(yīng)的研究進(jìn)展[J].分子植物育種，2018，16（9）：3006-3015

[2]Miller G，Suzuki N，Ciftci-Yilmaz S，Mittler R（2010）Reactive oxygen species homeostasis and signalling during drought and salinity stresses. Plant Cell Environment 33，453–467.

[3]Bose J， Rodrigo-Moreno A， Shabala S （2014） ROS homeostasis in halophytes in the context of salinity stress tolerance. Journal of Experimental Botany 65，1241-1257.

[4]高林，陳春麗.NaCl脅迫對(duì)水稻品種中花11幼苗根系生長(zhǎng)發(fā)育的影響[J].種子，2012，31（7）：7-10

[5]吳麟，張偉偉，葛曉敏，唐羅忠.植物對(duì)淹水脅迫的響應(yīng)機(jī)制研究進(jìn)展[J].世界林業(yè)研究，2012：27-33

[6]萬春陽，王丹，侯俊玲，王文全等.NaCl脅迫對(duì)甘草生長(zhǎng)及抗氧化酶活性的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011：1805-1809

[7]楊國(guó)會(huì)，石德成.NaCl脅迫對(duì)甘草葉片相對(duì)含水量及保護(hù)酶活性的影響[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，12（23）：1004-3208

[8]梁曉薇，梅凌鋒，張春榮等.組織培養(yǎng)條件下甘草種子休眠解除方法的優(yōu)化[J].中藥農(nóng)業(yè)，2016（3）：339-342.

[9]楊國(guó)會(huì)，石德成.NaCl和NaCO脅迫對(duì)甘草幼苗膜質(zhì)過氧化作用的影響[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48（10）：2411-2413

[10]吳秋敏，蘇平，劉蕓.黃酮的抗氧化性和促氧化性研究進(jìn)展[J]食品工業(yè)科技，2014（24）：379-383

[11]Xincheng Yao，Ling Zhu，Yuxin Chen，et al. In vivo and invitro antioxidant activity and a-glucosidase，a-amylase inhibitoryeffects of flavonoids from Cichorium glandulosum seeds[J]. FoodChemistry，2013（139）.

[12]鄭學(xué)欽，胡春.用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蘆丁等物質(zhì)清除超氧陰離子活性氧的作用[ J].中國(guó)藥學(xué)雜志，1997，32（3）：140-142

[13]萬世杰，梁玉玲.NaCl脅迫對(duì)脹果甘草子葉愈傷組織總黃酮合成的影響[J].農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（4）：151-152.