疊氮化鈉誘導細胞線粒體損傷及mtDNA的釋放

胡好 江亭 方義軍 傅雅娟

摘? ?要：線粒體是真核細胞中具有重大作用的細胞器，在調控細胞凋亡等方面也發揮著重要作用。一旦線粒體受到損傷且無法發揮其正常功能，將會導致細胞內環境變化，最終導致組織、器官損傷病變，尤其對能量要求較高的一些組織或者器官影響很大。希望探索線粒體損傷機制，減少線粒體損傷及其影響。通過疊氮化鈉建立線粒體損傷模型，并通過檢測疊氮化鈉刺激后細胞中腺嘌呤核苷三磷酸水平以及線粒體膜電位變化情況等方法證實建立的線粒體損傷模型是有效的，可用于線粒體損傷機制的研究。成功使用疊氮化鈉刺激L929細胞系建立線粒體損傷模型，并在離體線粒體損傷中檢測到mtDNA的釋放。疊氮化鈉使用的最佳質量濃度會對線粒體產生損傷，并影響其正常功能，且對細胞活率影響不大。

關鍵詞：疊氮化鈉;線粒體損傷;線粒體

線粒體是真核生物細胞中一種重要的細胞器，通過有氧呼吸為細胞活動提供能量，維持細胞內離子平衡，產生活性氧，通過與內質網等合作維持細胞中鈣離子的動態平衡[1]，通過控制膜電位調控細胞增殖、凋亡。所以一旦線粒體損傷會對細胞的生命活動造成很大的影響，會影響腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine Triphosphate，ATP）的產生，從而產生過多的氧自由基，使得線粒體膜電位發生變化、功能紊亂，引發細胞凋亡。在植物中，線粒體功能障礙與細胞質雄性不育有直接聯系[2]。植物線粒體中的物質運輸、呼吸作用等對能量需求極高，能量的供應直接影響整個植物的生命活動[3]。目前研究發現，線粒體涉及細胞生長、增殖、分化和凋亡等各個方面。線粒體功能衰退導致氧自由基大幅度增加，使得細胞衰老;線粒體的結構、功能以及數目的異常會引發心肌能量代謝異常[4]，線粒體自噬在心肌缺血的作用也逐漸引起研究學者的注意;1996年，Varming[5]利用疊氮化鈉誘發的線粒體損傷模型篩選潛在的神經保護的化合物。在細胞環境中加入疊氮化鈉希望造成線粒體損傷，成功建立線粒體損傷模型，有利于了解線粒體損傷發生的機制、了解線粒體疾病發病機制，篩選治療線粒體損傷疾病的治療藥物。

1? ? 材料與方法

1.1? 主要試劑

主要試劑如表1所示。

1.2? 細胞生存率的測定

將L929細胞以合適密度鋪在96孔板中，過夜培養，12 h后加入10 μL不同質量濃度疊氮化鈉刺激，對照組加10 μL磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）。放入培養箱一段時間后，使得疊氮化鈉進入細胞并造成損傷，每孔各添加20 μL MTT溶液，孵育4 h，有活性的琥珀酸脫氫酶可將MTT還原得到甲瓚，藍紫色結晶沉淀。之后吸取上清，在96孔板中每孔添加200 μL DMSO用于溶解甲瓚。最后使用酶標儀讀取波長490處甲瓚的OD值。死細胞中沒有還原甲瓚，通過這種方式判斷細胞生存率。

1.3? 線粒體膜電位的測定

同上步驟，將載玻片洗干凈固定并加入細胞過夜培養使細胞貼壁。第二天更換培養基并加不同質量濃度疊氮化鈉刺激。空白對照加同等體積PBS緩沖液，陽性對照加入碳酰氰基-對-氯苯腙（CCCP），共孵育6 h，用PBS洗滌一次后，加入1 mL新鮮培養基和1 mL的JC-1染色工作液，37 ℃孵育20 min完成后，使用染色緩沖液清洗，最后使用多聚甲醛固定，用熒光共聚焦顯微鏡觀察。若是觀察到大批紅光，判斷線粒體膜電位正常;若觀察到綠光，則判斷線粒體膜電位不正常。

1.4? 三磷酸腺苷含量的測定

首先，將L929細胞鋪于6孔板中，饑餓處理12 h后，加入不同質量濃度疊氮化鈉刺激細胞，刺激6 h后破碎細胞，從上清中提取其中ATP，并使用試劑盒中裂解緩沖液稀釋ATP標準品，將樣品和標準品混勻，保持低溫，用酶標儀檢測相對光單位（relative light unit，RLU）值。最后計算ATP質量分數。

1.5? 小鼠肝臟線粒體體外損傷

本實驗選擇易于得到的小鼠肝臟作為線粒體來源，肝臟細胞內含有大量線粒體。將小鼠麻醉，快速取出肝臟，剪掉多余組織，用手術刀快速切成小的薄片，使用勻漿緩沖液沖洗表面血色，在Dounce勻漿器中制備組織勻漿。勻漿結束后，1 300 g離心10 min，取上清，再次離心，重復幾次后，吸出上清，置于冰上保存，最后使用17 000 g高速離心15 min使線粒體沉淀，棄去上清，用緩沖液漂洗線粒體3遍。

實驗需要得到純線粒體，需要上步得到的線粒體去掉雜質，首先將線粒體儲液低速離心，此時沉淀是含有大量雜質的線粒體，使用15%的percoll溶液重懸，使用吸管小心加到40% percoll上，利用密度梯度離心5 000 g離心25 min，純線粒體位于15%和40% percoll界面之間，小心吸出，17 000 g離心10 min，使用少量測試緩沖液重懸沉淀，得到的即是純線粒體。將純線粒體均分成3份，分別加入PBS緩沖液和疊氮化鈉（50 mmol/L）置于37 ℃培養箱反應15 min，取出后將線粒體離心沉淀，檢測上清液中核DNA和mtDNA的表達。

2? ? 結果與討論

2.1? 疊氮化鈉刺激L929細胞后降低細胞活率

使用MTT的傳統方法檢測疊氮化鈉刺激細胞后細胞數量的變化。通過加入不同質量濃度的疊氮化鈉與L929細胞共孵育，在不同時間檢測疊氮化鈉對L929細胞的影響，判斷疊氮化鈉質量分數過低，則無法對線粒體造成損傷，若質量分數過高，則細胞死亡過多。通過結果可以看出，200 mmol/L的疊氮化鈉與L929細胞共孵育6 h后，細胞存活率幾乎降到10%，50 mmol/L和100 mmol/L疊氮化鈉刺激對細胞活率的影響較為接近。

2.2? NaN3刺激L929細胞后線粒體膜電位的變化

線粒體功能的正常實施必須具備有效的線粒體膜電位，使用JC-1探針檢測使用疊氮化鈉刺激后細胞膜電位是否變化，其中，CCCP為陽性刺激物，可在較短時間內顯著性損傷線粒體膜電位。由圖2可以看出control組JC-1聚合物比列較高，觀察到強烈紅光，而CCCP對照組和50 mmol/L疊氮化鈉處理組的紅光都很弱，判斷疊氮化鈉對線粒體的膜電位造成了顯著性損傷。

2.3? NaN3刺激L929細胞后細胞內ATP質量分數的變化

本實驗采用ATP檢測試劑盒檢測不同質量濃度疊氮化鈉處理后細胞內ATP總量的變化。表2—3分別為ATP標準品和疊氮化鈉處理組的RLU讀數。從圖3—4可以看出，隨著疊氮化鈉刺激質量濃度的升高，L929細胞ATP的合成能力下降。

2.4? NaN3刺激離體線粒體

經percoll分離獲得的小鼠肝臟線粒體，均分兩份，并重懸于緩沖溶液中，分別加入疊氮化鈉和等體積PBS。如圖5—6所示，用50 mmol/L的疊氮化鈉處理離體線粒體后，有大量的mtDNA釋放到線粒體外。

3? ? 結語

線粒體作為真核細胞中重要的細胞器，一旦線粒體損傷，無法正常發揮功能，對細胞的自身影響巨大。有研究報道，在過去的20年中，線粒體DNA（mtDNA）的突變已成為人類遺傳疾病的主要原因。臨床上，這種疾病在10 000名成年人中有1名，但在200個背景人群中有1個發現了致病性突變。已有大量研究證實，疊氮化鈉可以有效抑制線粒體呼吸鏈復合物IV，抑制ATP合成、超氧化歧化酶和DNA合成酶的活性。

使用疊氮化鈉進行線粒體損傷模型，使用疊氮化鈉刺激后會對細胞活率造成影響，使用MTT法檢測不同質量濃度的疊氮化鈉對細胞活率的影響，在使用疊氮化鈉刺激時減小對細胞活率的影響;通過檢測細胞ATP的方法觀察隨著疊氮化鈉的濃度升高，細胞內ATP含量顯著下降;激光共聚焦顯示，50 mmol/L質量濃度疊氮化鈉對細胞造成了線粒體的明顯損傷，膜電位極性不正常。以上證實線粒體損傷模型的建立是成功的。另外，在損傷模型中發現，線粒體損傷后，會有mtDNA釋放到胞質中，這是因為mtDNA沒有組蛋白的保護，對氧自由基引發的氧化損傷極為敏感，線粒體損傷會導致電子傳遞鏈中電子泄露，電子泄露引起氧自由基釋放，mtDNA沒有組蛋白的保護在高變區極易斷裂進而釋放到線粒體外。本實驗探索了一個合適的線粒體損傷條件，這對研究線粒體損傷機制尤為重要。

[參考文獻]

[1]MARCHI D，BONORA E M，GIORGI C，et al.The mitochondrial permeability transition pore is a dispensable element for mitochondrial calcium efflux[J].Cell Calcium，2014，56（1）：1-13.

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[3]宋海泉.植物線粒體的物質運輸[J].長沙水電師院學報，1988（3）：95-101.

[4]LIU T，TAKIMOTO E，DIMAANO V L，et al.Inhibiting mitochondrial Na+/Ca2+ exchange prevents sudden death in a guinea pig model of heart failure[J].Circulation Research，2014，115（1）：44-54.

[5]VARMING T，DREJER J，FRANDSEN A，et al.Characterization of a chemical anoxia model in cerebellar granule neurons using sodium azide：Protection by nifedipine and MK-801[J].Journal of Neuroscience Research，1996，44（1）：40-46.