GYY4137和雙膦酸鹽對去勢大鼠骨質疏松癥治療效果的對比研究

戴楓 黃國鑫 徐忠世

摘要：目的 通過測量大鼠椎體及股骨骨密度、股骨生物應力數據及顯微鏡下觀察股骨骨小梁微觀結構，對比研究分析外源性 H2S?供體 GYY4137 及雙膦酸鹽類代表藥物阿侖膦酸鈉對去勢大鼠骨質疏松癥的治療效果。方法 通過切除大鼠雙側卵巢建立經典的骨質疏松模型，模擬圍絕經期婦女雌激素驟減、神經內分泌紊亂所致的骨質疏松疾病過程，大鼠隨機分組通過腹腔注射 GYY4137 或阿侖膦酸鈉進行干預，使用改良亞甲藍法測定血漿硫化氫濃度，使用雙能 X 射線骨密度儀測量第

4、5?腰椎椎體及股骨骨密度;通過股骨三點彎曲實驗測量股骨骨折最大應力值。所有數據由 SPSS?22.0?軟件處理分析。同時在顯微鏡下微觀定性對比觀察各組大鼠股骨 H&E ?染色切片骨小梁分布情況。結果 ?去勢大鼠骨質疏松模型下，腹腔注射

GYY4137 模擬內源性 H2S 可提高了血漿 H2S 濃度，在顯微鏡下觀察到股骨骨小梁微觀結構的明顯改善，與阿侖膦酸鈉治療組無明顯差異，在各個時間段 GYY4137 和阿侖膦酸鈉干預組在第 4、5 腰椎骨密度及股骨最大應力負荷測量數據上同正常對照組無統計學意義上的差別（p>0.05）。在第 12 周，大鼠第 4 腰椎骨密度和大鼠股骨骨密度在 GYY4137 干預組較 OVX 實驗對照組有增加（p<0.05）。結論 GYY4137 作為近年熱點研究的一種新型 H2S 緩釋供體，在實驗中和阿侖膦酸鈉的干預效果類同，對去勢大鼠骨質疏松癥的治療有效。

關鍵詞：雌激素;骨質疏松;H2S;骨密度;最大應力;去卵巢

【中圖分類號】R681 【文獻標識碼】A 【文章編號】2107-2306（2019）05-005-03

骨質疏松伴隨骨量減少和骨脆性增加，極易造成骨折和傷殘等并發癥，嚴重影響患者的身體健康和生活質量， 甚至縮短患者壽命 [1]。骨質疏松最常發生于絕經后婦女， 被稱為絕經后骨質疏松癥 （PMOP） [2]，雌激素和多種內源性激素在體內調節影響著骨代謝，補充外源性激素進行替代治療是目前常用的治療手段之一，但同時增加了患者生殖系統腫瘤的風險 [3]。在研究中，我們選取了去卵巢大鼠這一經典實驗模型來模擬絕經后骨質疏松的病理過程。證實了外源性腹腔注射 GYY4137 可以提高大鼠血漿的 H2S 濃度水平，提高了大鼠腰椎及股骨骨密度數據，抵消反轉了因雌激素缺乏所致對骨代謝的相關影響，微觀上股骨 HE 染色的鏡下觀察也佐證了干預治療效果，GYY4137 干預下

OVX?大鼠股骨骨小梁的微觀結構和正常對照組及阿侖膦酸鈉干預組相差無幾。

1.1?試劑和化學物質

GYY4137 購買于 Santa Cruz Biotechnology （SC-224013）， 使用 0.9% 的生理鹽水稀釋。

阿倫瞵酸鈉（阿拉丁，A115345），同樣使用 0.9% 的生理鹽水稀釋。

水合氯醛（Sangon Biotech， Shanghai， China）

青霉素、戊巴比妥鈉、生理鹽水等均購于正規國內生產廠商。

1.2?動物實驗材料和方法

80?只 6?月齡 SPF?級雌性 SD?大鼠，體重 265±15g，購于廣東省實驗動物中心。大鼠適應性飼養 1?周后進行分組和骨質疏松造模，隨機分為正常對照組（sham-GYY）、實驗對照組 （OVX-vehicle）、GYY4137（GYY）干預組 （OVX-

GYY）?和阿倫瞵酸鈉干預組 （OVX-ALEN）。每組 20?只;其中實驗對照組、GYY4137（GYY）干預組和阿倫瞵酸鈉干預組進行骨質疏松造模，大鼠使用 320mg/kg?劑量水合氯醛麻醉后，腹部開口，完整摘除雙側卵巢（ovariectomy，

OVX），關腹。正常對照組大鼠進行假手術處理：大鼠開腹后分離卵巢組織，關腹，不做卵巢切除術 ， 手術過程中動物無大出血。術后待大鼠自然清醒，青霉素（4?萬U/?只） 治療 3 天避免感染。術后，正常對照組大鼠腹腔注 100μg/ kg?GYY4137（santa?cruz，sc-224013），實驗對照組大鼠腹

腔注射 1mg/kg?生理鹽水，阿倫瞵酸鈉干預組大鼠皮下注射 1mg/kg?阿侖膦酸鈉（?阿拉丁，A115345），GYY4137 干預組大鼠腹腔注射 100μg/kg?GYY4137（santa?cruz，sc-

224013），用藥次數均為 2?天 /?次。于給藥 2、4、8、12?周后每組各 5?只大鼠使用戊巴比妥鈉注射麻醉，腹主動脈采血，分離血漿。于給藥 2、4、8、12?周后每組各處死 5?只大鼠，完整取出雙側股骨，剔除軟組織和附件。于給藥 8、

12?周后完整取出各組大鼠腰椎體，同樣剔除軟組織和附件， 僅僅保留椎體。股骨和腰椎椎體用浸透生理鹽水的紗布包裹后，分組標記保存于-80℃冰箱中。大鼠由專人飼養，在溫度 23±2℃，相對濕度 55±10%?以及晝夜交替各 12?小時

的受控條件下，自由進食和飲水。實驗期為 12 周，實驗過程中沒有大鼠意外死亡。以上所有的實驗步驟均嚴格按照中國科技部的《實驗動物的管理和使用指南》進行。

1.3?血漿 H2S 濃度檢測

改良亞甲基藍法測定血漿硫化氫，先加過量醋酸鋅溶液使血漿中游離 H2S、HS-、S2-?形成 ZnS?沉淀; 再加入5mol/L NaOH?強堿溶解變性的蛋白;離心去除大量蛋白質; 再加入 0.2% N，N-?二甲基對苯二胺鹽酸鹽溶液使 ZnS?完全溶解，用三氯乙酸沉淀剩余蛋白質，最后用分光光度計法測定 H2S?濃度。

1.4?H&E 染 色 （Hematoxylin-eosin?staining）

在 4% 濃度的多聚甲醛固定后，股骨樣品脫鈣，然后再遞增濃度的乙醇中脫水，再二甲苯中清洗并植入組織學石蠟中，使用厚度為 5μm 切片進行 H&E 染色。

1.5?骨密度檢測

骨密度檢測使用美國產 Hologic 雙能 X 射線 4500W 骨密度儀（DEXA）分次測定第 4、第 5 腰椎椎體和雙側股骨骨密度（BMD）。

1.6?生物力學檢測

取股骨樣本進行生物力學檢測，方法為三點彎曲實驗， 測量股骨骨折時所承受的最大應力。儀器為 ElectroForce 3200 Series II Test Instrument，BOSE。

1.7?統計學方法

各組數據以均數 ± 標準差表示，使用 SPSS 22.0 軟件進行處理，根據方差齊性檢驗結果，兩組間比較采用兩樣本 t 檢驗。P ﹤ 0.05 認為差異具有統計學意義 ， P ﹤ 0.01 認為差異具有顯著性。

2.1?各組血漿 H2S 濃度的變化

和 Sham-GYY?組比較，OVX-vehicle?和 OVX-ALEN?血漿中硫化氫（H2S）含量均有下降或顯著降低，而 OVX-

GYY?組血漿中硫化氫含量變化不明顯。如圖 1。通過腹腔注射 GYY?在第 2?周和第 4?周顯著提高了的 OVX?大鼠血漿 ?H2S ??濃 ?度 ，（13.47±3.64 vs. 5.00±1.33;11.28±1.95?vs.

5.08±2.36;所有 p<0.01，如圖 1），隨著時間推移，在第

8?周和第 12?周外源性 GYY?對大鼠血漿 H2S?濃度的提升影響仍顯示有效（11.20±3.53?vs.?5.63±2.32;13.08±2.99?vs.

5.98±2.06;所以 p<0.05，如圖 1）。

組 sham-GYY?比較; # 表示 p<0.05，?與實驗對照組 OVX-

vehicle 比較;## 表示 p<0.01， 與實驗對照組 OVX-vehicle 比較）

2.2?股骨組織的切片 H&E 在顯微鏡下觀察

實驗對照組在顯微鏡下可以觀察到骨小梁結構的明顯崩塌減少稀疏，這確認 OVX 骨質疏松造模的成功，而OVX-ALEN 和 OVX-GYY 組可以觀察到大鼠股骨骨小梁的恢復，這個結果定性顯示了補充外源性 H2S 和阿倫瞵酸鈉均對骨質疏松病情的恢復和改善有治療效果（如圖 2）。

2.3?GYY4137?減緩去卵巢疏松和腰椎股骨骨密度減低于正常對照組比較，大鼠第 4、5?腰椎于去卵巢后

（OVX-vehicle）第 8 周及之后第 12 周均顯示骨質密度減低

（0.195±0.007 vs. 0.244±0.023;0.193±0.017 vs.?0.239±0.013; 0.182±0.022 vs. 0.223±0.016;0.180±0.023 vs.?0.232±0.026;

所有 p<0.05;如圖 3）;差異存在統計學意義。同時在第

12?周大鼠第 4?椎體樣本結果顯示 GYY4137?干預組 （OVX-

GYY）?反轉了去卵巢導致的腰椎骨密度降低（0.190±0.040 vs.?0.182±0.022;p<0.05;?如圖 3c）;?對骨質疏松的治療效果甚至優于同組阿倫瞵酸鈉干預組 （OVX-ALEN）。在大鼠雙側股骨骨密度測量實驗中顯示，第 12?周實驗對照組 （OVX-vehicle）?相比正常對照組（sham-GYY）股骨密度降低（0.260±0.030?vs.?0.332±0.035;p<0.05;?如圖 4b）， 通過阿倫瞵酸鈉干預組 （OVX-ALEN）?和 GYY4137?干預組（OVX-GYY）?反轉了實驗對照組 （OVX-vehicle）?去卵巢導致的股骨密度減低（0.310±0.023?0.314±0.046?vs.?0.260±0.030;

p<0.05;如圖 4b），數據結果顯示阿倫瞵酸鈉和 GYY4137 對骨質疏松治療效果基本相同。

周測量圖示。（*?表示 p<0.05，?與正常對照組 sham-GYY 比較;**?表示 p<0.01，?與正常對照組 sham-GYY?比較;

# 表示 p<0.05，與實驗對照組 OVX-vehicle 比較;## 表示p<0.01，與實驗對照組 OVX-vehicle 比較）

（*?表示 p<0.05，與正常對照組 sham-GYY?比較;**?表示

p<0.01，與正常對照組sham-GYY 比較; # 表示p<0.05，與實驗對照組 OVX-vehicle 比較;## 表示 p<0.01，與實驗對照組 OVX-vehicle 比較）

2.4?股骨骨折最大應力測試

股骨骨折最大應力測試，通過格拉布斯準則法（Grubbs） 剔除相關異常值，結果分析表明：在 12?周時實驗對照組（OVX-vehicle）?大鼠股骨三點彎曲實驗所承受的最大骨折應力數值有下降（121.59±26.56?vs.?157.79±14.83;p<0.05;如圖 5b），OVX 骨質疏松模型改變了大鼠股骨的最大生物力學載荷，符合骨質疏松的發生。而通過阿拉丁和 GYY4137 干預的大鼠，最大負荷應力與正常對照組無明確統計學差別（p>0.05）; 而阿拉丁和GYY4137 干預組之間進行對比， 也無明顯統計學差別（p>0.05;圖 5ab）。

圖 5 大鼠雙側股骨骨折最大應力數值：a 第八周大鼠雙側股骨樣本骨折最大應力圖示;b 第 12 周大鼠雙側股骨樣本骨折最大應力圖示。（* 表示 p<0.05，與正常對照組sham-GYY 比較;** 表示 p<0.01，與正常對照組 sham-GYY 比較; # 表示p<0.05，與實驗對照組 OVX-vehicle 比較;## 表示 p<0.01，與實驗對照組 OVX-vehicle 比較）

在我們的研究中，通過實驗大鼠去卵巢來重現模擬了絕經后骨質疏松的病理過程，股骨 HE?染色的鏡下微觀骨小梁觀察、大鼠腰椎及股骨骨密度、大鼠股骨最大骨折應

力數據均確切表明去卵巢大鼠骨質疏松這一經典實驗模型的成立。通過腹腔注射外源性 H2S?供體 GYY?可以有效提高大鼠血漿的 H2S?濃度水平，改善反轉了因雌激素缺乏導致的大鼠腰椎骨密度和股骨最大應力降低，多組實驗數據顯示阿倫瞵酸鈉干預組 （OVX-ALEN）?和 GYY4137?干預組（OVX-GYY）?對比正常對照組大鼠無統計學意義上的差別， 在第 12?周大鼠第 4?腰椎骨密度數據顯示 GYY?甚至優于阿倫瞵酸鈉的干預治療效果，大鼠股骨的鏡下對比觀察也證實了這一點，GYY?的干預下 OVX?大鼠股骨骨小梁的結構和數目和正常對照組及阿侖膦酸鈉干預組無顯著性差別。

骨代謝在分子層面的調節同時存在多種信號通路相互影響，其對骨形成和骨吸收起著重要的作用 [4]。其中骨形成發生蛋白（BMP）/Smads?通路及 Wnt/β-?連環蛋白

（catenin）通路主要影響骨形成，而骨保護素（OPG）/?核因子 κ?B受體活化因子配體（RANKL）/?核因子 κ?B受體活化因子（RANK）通路則主要影響骨吸收。有研究表明，骨髓間充質干細胞產生的H2S 可以調節成骨分化，H2S 減少缺乏可使鈣離子通道的巰基化減少，影響細胞壁 Ca2

+ 通道的內流，進而下調 PKC/ERK?介導的 Wnt/β-catenin 信號通路調控的間充質干細胞向成骨細胞分化。H2S?還可通過影響 BMP/Smads?通路的重要轉錄因子核心結合蛋白（Cbfα1/?Runx2）?和 Osterix?相互作用， 促進骨細胞的增值和分化，以及進一步啟動成骨細胞特異性因子（如堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原和骨鈣蛋白）的表達，從而促進骨的形成

[6]。BMP/Smads?和 Wnt/β-catenin?信號通路存在相互調節作用 [7]，H2S?同樣也在實驗中觀察到通過 MAPKs?途徑中的

EPK1/2 和 p38 依賴的機制對抗氧化應激損傷，促進成骨細胞的分化和增殖，減輕炎癥反應 [8]。這些報道和本實驗的結果一致并相互驗證，說明了 H2S 對骨代謝的有益作用， 具有潛在改善骨質結果的效果。

傳統上硫化氫被認為是一種劇毒臭雞蛋氣味的有害物質，高濃度下的毒性作用主要由于其抑制線粒體中的細胞色素 C 氧化酶，對線粒體的抑制作用甚至強于氰化物，有報道 H2S 在人體中毒時血液硫離子濃度為 3-995μM[9]。生理濃度和最低中毒濃度較為接近，高劑量的 H2S 甚至可誘

導實驗鼠脂多糖介導的炎癥反應以及感染性休克患者血漿H2S 濃度同步增高 [10]。本動物實驗以大鼠為研究對象，而實際上外源性 H2S 對人體的實驗數據結果可能存在差異， 不同濃度的硫化氫、不同的給藥方式、給藥速度對骨質疏松的影響及其長期使用對心肝腎等重要臟器功能的影響有待進一步實驗觀察確認，總之，本研究創新性地對比觀察了 GYY4137 和雙膦酸鹽類藥物阿侖膦酸鈉對去勢大鼠骨質疏松癥的實際治療效果。結論表明外源性給予 GYY4137 來提高血漿 H2S 濃度有益大鼠骨質疏松癥的治療，這或許是另一個人類骨質疏松癥的治療的潛在靶點，對今后骨質疏松癥的新藥開發研究具有有益的提示作用。

639-650.

oxidative stress and its acceleration by loss of sex steroids. J Biol Chem. 2007;282（37）：27285–97