鷹嘴豆芽素A通過抑制破骨細胞分化、改善Perthes病股骨頭骨骺畸形愈合

廖世杰 李波香 馮文宇 劉云 羅愷 丁曉飛 趙勁民

[ 摘要] 目的 研究中藥單體鷹嘴豆芽素 A?對Perthes 病股骨頭畸形、對破骨細胞分化以及破骨細胞功能的影響，以找尋治療和預防該病的藥物。方法 建立股骨頭缺血性壞死動物模型，鷹嘴豆芽素 A?干預后觀察股骨頭形態學改變。不同濃度鷹嘴豆芽素A 干預 RANKL?誘導的破骨細胞分化，TRAP?染色后觀察破骨細胞數量改變，RT-PCR?檢測 TRAP、MMP-9?水平。結果 鷹嘴豆芽素 A?可以緩解股骨頭缺血性壞死后畸形，抑制破骨細胞的形成以及標志基因 TRAP、MMP-9?表達。結論 鷹嘴豆芽素 A 可以預防股骨頭缺血性壞死，是可預防股骨頭缺血性壞死后畸形的潛在藥物。

關鍵詞：鷹嘴豆芽素 A;兒童股骨頭缺血性壞死;破骨細胞;中藥單體

【中圖分類號】R816.8 【文獻標識碼】A 【文章編號】2107-2306（2019）05-010-03

股骨頭缺血性壞死（ischemic osteonecrosis of the femoral head ，ONFH）可發生于成人或兒童中，是由各種原因造成股骨頭缺血后發生的髖部疾患。Legg-Calvé-Perthes disease，簡稱 Perthes 病，是發生于兒童的特發性股骨頭缺血性壞死 [1]。

股骨頭骨骺缺血壞死愈合后可遺留不同程度畸形，嚴重影響兒童的身心健康，是青年髖關節置換的主要原因之一 [2] 。

股骨頭缺血壞死后破骨細胞異常激活和隨之而來的局部骨溶解是股骨頭骨骺畸形愈合的重要原因 [3-5]。骨髓來源的造血祖細胞在多種細胞因子的刺激下向壞死區遷移形成破骨細胞，執行骨吸收功能。鷹嘴豆芽素 A?主要來源于鷹嘴豆芽素豆、紅車軸草全草，屬于黃酮類天然化合物。鷹嘴豆芽素有許多藥理特性，如：抗氧化、抗炎及抗腫瘤等 [6]。既往研究表明，鷹嘴豆芽素 A?可通過抑制破骨細胞的活化來改善絕經后骨質疏松癥。但兒童股骨頭缺血性壞死破骨細胞分化的機制與骨質疏松癥不完全相同，本研究通過體內及體外實驗探究鷹嘴豆芽素A?對Perthes?病股骨頭骨骺畸形愈合的預防作用。 ??????????? ??????????????????????????????????????????????????1?材料與方法

1.1?動物和實驗材料

本實驗使用雄性 Sprague-Dawley?大鼠（8?周齡，廣西醫科大學動物實驗中心，中國）。大鼠在 SPF?級動物房中飼養，可自由活動、獲取食物和水。鷹嘴豆芽素 A（純度> 99% ， 購自成都曼斯特生物科技有限公司）， 溶于二甲基亞砜（Aladdin?試劑公司）。培養基 α-MEM?和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購于 Gibco BRL。重組可溶性巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）和重組小鼠可溶性 RANKL 購于美國R&D公司。CCK-8 購自Beyotime生物技術研究所。 TRAP染色試劑盒購于Sigma-Aldrich。其他化學品購自 Sigma 公司。

1.2?實驗設計

該實驗得到廣西醫科大學倫理委員會批準。 12?只大鼠隨機分為 4?組：假手術組（Sham，n?= 6），骨壞死組（ON， n?= 6），鷹嘴豆芽素 A?治療的骨壞死組（ON?+ 鷹嘴豆芽素 A，n?= 6）。動物模型的建立，采用經典的股骨頸環扎法 [7，8]。簡而言之，在麻醉后，在右側股骨大轉子上方的皮膚上縱向切開皮膚，分離臀大肌和臀中肌以暴露關節囊。打開關節囊，用不可吸收線結扎股骨頸（# 3-0 Vicryl， Ethicon）。股骨頭復位后，逐層縫合肌肉和皮膚。假手術組僅解剖關節囊，不結扎股骨頸。手術后，鷹嘴豆芽素 A

組隔天腹腔注射鷹嘴豆芽素 A（ 5 mg / kg），持續 4 周。假手術組和骨壞死組予相同劑量的 PBS。術后 4 周對所有動物實施安樂死。造模側股骨頭取材后用拍照觀察。

1.3?骨髓來源巨噬細胞（BMMs）提取 ????????????????????????????????4?周齡大的 C57BL?小鼠用于提取造血祖細胞。對小鼠

實行安樂死后，分離出小鼠股骨和脛骨，剪刀剪去兩端骨骺后，使用裝滿完全培養基的注射器將骨髓細胞從骨髓腔內沖出，即為骨髓造血祖細胞。 隨后將這些細胞轉移至

T75 培養瓶中，并加入含有 MCSF（30ng/mL）、10% FBS 的 α-MEM 的培養液，細胞在 37℃的 5% CO2 培養箱中培養 （ 下同 ）。即可得到 BMMs。

1.4?破骨細胞分化實驗

將 BMMs 從 T75 中消化下來后， 按 6×103 / 孔的密度轉移到 96 孔板中，使用完全培養基（含有 MCSF30 ng/ mL、RANKL 100 ng/mL 和 10% FBS 的 α-MEM 的培養液 ， 下同） 進行培養。 按鷹嘴豆芽素 A 濃度（0，2.5，5，10 和20μM）進行分組，并設置不加 RANKL 的陰性對照組。按上述培養條件孵育細胞，隔天換液至 7 天，顯微鏡下觀

察出現 3 個核及以上巨噬細胞即判斷為破骨細胞。此時用PBS 清洗培養液并用 4% 多聚甲醛固定細胞。避光條件下使用TRAP 染色試劑盒染色15 分鐘。隨后下顯微鏡下拍照， 超過三個細胞核并且 TRAP 染色陽性即為破骨細胞，記錄其數量和總細胞數。

1.5?細胞毒性實驗

使用 CCK-8 試劑盒來檢測不同濃度鷹嘴豆芽素 A 對BMMs 的細胞毒性作用。 按 6×103 細胞密度，使用完全α-MEM 培養基將細胞種于 96 孔板中，按鷹嘴豆芽素濃度分組（0，2.5，5.0，10，20 和 40μM），每個分組有 3 個副孔。培養 48 小時后，按 CCK8 說明書要求，向每個孔中加入 10μL CCK-8 緩沖液，按要求培養 4 小時。 使用吸光度酶標儀（Infinite M1000 PRO，Tecan）在 450nm 下測量每個孔的吸光度。

1.6?聚合酶鏈式反應 （PCR）

將上述 BMMs 按 1. 2×105 個細胞 / 每孔種入 6 孔板中， 用含 30 ng /mL M CSF 和 100 ng /mL RANKL 的培養液培養，并用鷹嘴豆芽素 A（0，5，10 和 20μM） 干預。上述條件培養細胞，每 48 小時換液至第 5 天。當顯微鏡下觀察到鷹嘴豆芽素 （ 0μM） 出現大而融合的破骨細胞時，即用Trizol 將細胞裂解，按相關操作說明提取總 RNA，再將總RNA 逆轉錄成 cDNA。然后，使用 Real - Time PCR 儀器檢測 ACP5 （ TRAP ）、MMP9 基因的擴增情況。序列。

1.7?統計學分析

數據表示為平均值 ± 標準偏差（SD）。 用獨立樣本

t 檢驗（對于兩組）或單向 ANOVA（對于兩組以上）分析數據。通過Pearson 相關系數檢驗進行參數間的相關分析。假設統計學顯著性為 P < 0.05。 星號（*，** 和 ***）分別代表 P < 0.05，P < 0.01 和 P < 0.001。

2.1?鷹嘴豆芽素 A?可改善股骨頭缺血性壞死后股骨頭

畸形

股骨頭骨骺血供中斷是 Perthes 病發病的中心環節，我們采用經典的股骨頸環扎法建立動物模型。建模后 4 周， 與假手術組大鼠相比，骨壞死組大鼠股骨頭外觀呈明顯扁平狀畸形，股骨頭骨骺出現骨壞死（圖 1 A，B）。結果與以往文獻報道一致。與假手術組比較，鷹嘴豆芽素 A 治療組股骨頭骨骺稍扁平，但是畸形程度較缺血性骨壞死組大鼠輕（圖 1 A，B 和 C）。大體觀結果初步提示鷹嘴豆芽素

A 可改善股骨頭缺血性壞死后畸形。

2.2?鷹嘴豆芽素 A 抑制破骨細胞分化

目前研究表明，破骨細胞過度活化促進了股骨頭壞死后畸形愈合，因此我們進行體外實驗：觀察鷹嘴豆芽素 A 對破骨細胞分化的影響。如圖 2-A?所示，陰性對照組中未看到 TRAP?陽性破骨細胞。陽性對照組中清楚地觀察到大量 TRAP?陽性破骨細胞，不同濃度的鷹嘴豆芽素 A?處理后破骨細胞的數量有明顯差異（圖 2-B）。我們對各個分組進行破骨細胞進行計算。結果表明，20μM?組破骨細胞數為98.68±6.642 /?孔，顯著低于10.00μM?組（147±4.509 /?孔）、

5.00μM?組（172±9.074 /?孔）、2.5μM?組（265±5.508/?孔） 和對照組（271.3±11.22/ 孔）（圖 2-A）。統計學分析表明， 組間的差異具有統計學差異（圖 2?B）。因此，鷹嘴豆芽素

A 可抑制 RANKL 誘導的破骨細胞分化，抑制程度與藥物濃度呈正相關。

2.3?鷹嘴豆芽素 A 對破骨細胞沒有細胞毒性

為了排除是否鷹嘴豆芽素 A 對破骨細胞細胞毒性導致破骨細胞數量減低，我們進行了 CCK-8 試驗。結果表明， 高濃度的藥物有顯著細胞毒性，但本研究中， 鷹嘴豆芽素

A?刺激 BMMs?48 小時后，使用的藥物濃度（0，2.5，5.0，10，

20?和 40μM）對 BMMs?活性沒有顯著的細胞毒性作（圖 2

C）。 這些結果表明，鷹嘴豆芽素抑制破骨細胞分化時沒有明顯的細胞毒性。

2.4?鷹嘴豆芽素 A 抑制破骨細胞特異性基因轉錄

破骨細胞分化過程中可表達一些標志性基因，例如MMP-9， TRAP。TRAP?是破骨細胞分化的特異性基因，而MMP-9?在骨吸收是發揮重要作用。在該實驗中，將 BMMs 分成 3?組：對照組，用 RANKL?誘導的 BMMs?和用 RANKL 誘導并用鷹嘴豆芽素A?處理的BMMs。鷹嘴豆芽素 A（5，10 和20μM）可以抑制RANKL?誘導的MMP-9，TRAP?的轉錄， 與對照組（鷹嘴豆芽素 A 0μM）相比有統計學差異。

骨壞死區破骨細胞過度活化及造成的骨溶解，是

Perthes 病股骨頭骨骺畸形愈合的主要原因。因此，抑制破骨細胞分化可作為預防股骨頭股骨頭骨骺畸形愈合的潛在非手術方法。我們的體內實驗表明，鷹嘴豆芽素 A 治療組可改善股骨頭缺血性壞死后畸形。體外實驗結果表明，鷹嘴豆芽素 A 可在無細胞毒性的濃度范圍內抑制破骨細胞分化，可抑制破骨細胞分化特異性基因 TRAP 和MMP9 轉錄。因此，鷹嘴豆芽素 A 可作為改善股骨頭缺血性壞死后畸形的潛在天然活性藥物。

股骨頭缺血性壞死后病理改變促進了破骨細胞分化， 這些因素包括壞死物質持續存在 [3，5]，髖關節滑膜液中

IL-6、IL-17?顯著升高 [4]。這些條件共同構成了持續的骨壞死區慢性炎性改變。該環境下細胞因子可通過直接或間接途徑刺激 RANK、RANKL?表達而使得破骨細胞持續過度激活 [9]。其結果是造成股骨頭骨小梁過度吸收、力學強度下降和股骨頭骨骺塌陷，最終形成股骨頭扁平狀畸形 [10]。因此，抑制破骨細胞分化理論上可預防股骨頭骨骺畸形。

Kim?等 [11，12]?研究發現抑制 IL-6 表達或者競爭性拮抗 IL-6 受體都可通過抑制破骨細胞分化緩解股骨頭畸形。直接使用 RANKL?受體單抗，動物體內實驗證明具有治療 Perthes 病的效果 [13]。鷹嘴豆芽素 A 作為黃酮類化合物，可通過抑制破骨細胞的分化而改善絕經后骨質疏松癥的骨量丟失。但其在股骨頭缺血性壞死中的作用也未得到研究。我們的體內實驗表明，股骨頭壞死組股骨頭呈扁平狀畸形，有明顯的骨壞死。盡管較假手術組仍有畸形，但使用鷹嘴豆芽素 A?治療后，畸形程度可得到緩解。進一步體外實驗表明，在破骨細胞分化期間不同濃度的鷹嘴豆芽素 A?可降低

TRAP 染色陽性破骨細胞形成。而且這種效果呈濃度是呈濃度依賴的，CCK-8 實驗表明該藥物濃度下沒有細胞毒性。該結果和以往的研究結果類似。

破骨細胞分化過程中，RANKL 與其受體 RANK 結合后，可激活下游一系列信號通路，包括 MAPK 信號通路、NF-κB[14，15]。這些信號通路在破骨細胞分化的作用不同， 但是均可促進 c-FOS，NFATc1 轉錄因子的表達，進而促進破骨細胞內特異性基因的表達，經過轉錄和翻譯而發揮功能 [16]。TRAP 是破骨細胞分化中最特異性基因，其表達抗酒石酸酸性磷酸酶，該蛋白是破骨細胞分化的特異性蛋白。MMP-9 即金屬基質蛋白酶 9，其屬于金屬基質蛋白酶家族， 其在骨吸收中的作用是講解細胞外基質 [17]。我們的體內實驗表明，在抑制破骨細胞分化的濃度范圍內，鷹嘴豆芽素

A 可抑制 TRAP、MMP-9 的表達，該結果進一步解釋了鷹嘴豆芽素 A 抑制破骨細胞分化的機制。

鷹嘴豆芽素 A 可改善股骨頭缺血性壞死后畸形，其可能的機制是抑制破骨細胞分化。因此，鷹嘴豆芽素 A 可作為一種潛在的藥物用于改善股骨頭缺血性壞死后畸形。

• Kuroyanagi G， Adapala NS， Yamaguchi R， et al. Interleukin-6 deletion stimulates revascularization and new bone formation following ischemic osteonecrosis in a murine model[J]. Bone， 2018， 116： 221-231.

1946-1954.

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[ 作者簡介] 廖世杰（1985-），男，廣西梧州人，在讀博士，?主治醫師，主要從事創傷骨科、手外科及小兒骨科工作。

[ 通訊作者 ] 趙勁民，E-mail： zhaojinmin@126.com