單克隆抗體的穩定性研究進展

馬曉楠 張玲 王娜偉 鄭舒月 趙賀杰 趙思婷 張妮 馬寧寧

摘要：單克隆抗體（mAbs）是一種復雜的大分子蛋白，存在不穩定性現象。本文回顧了與單克隆抗體不穩定性相關的機制以及影響其穩定性的參數和條件（包括蛋白質結構、濃度、溫度和光照等），然后提出了用于理化穩定性和生物穩定性研究的不同分析方法，為單抗類藥物在臨床使用中達到更穩定的效果提供了一定的實際指導意義。

關鍵詞：單克隆抗體;蛋白質;穩定性研究

【中圖分類號】R-01【文獻標識碼】A【文章編號】2107-2306（2019）05-148-02

1.前言

自從1986年第一種單克隆抗體藥物Muromonab通過FDA的批準進入市場以來，單抗已經成為生物制藥領域中最重要的組成部分。單抗類藥物因其研發周期長、投入成本高，在專利期內受到保護，一旦專利期到，就會有許多其他公司加入到開發和生產的行列中23。

治療性抗體在利用CHO等哺乳動物細胞進行生產的過程中由于多種參數可能出現的變化，最終也可能引起重組蛋白的改變，如無法使用完全相同的細胞株克隆，培養條件和使用輔料的變化、長期培養過程中細胞株遺傳信息的不穩定性等，再加上抗體這樣的復雜蛋白不可避免地具有微異質性和不同的翻譯后修飾，都使得要對蛋白穩定性進行評估成為一個復雜的過程。

本文首先描述了影響單克隆抗體穩定性的相關機制與因素，然后列出了用于研究穩定性的不同分析方法，旨在為單克隆抗體的生產與臨床應用提供具有實際指導意義的信息。

2.單抗的不穩定性機制

蛋白質降解可能由多種不同機制引起，通常分為化學不穩定性和物理不穩定性。這些不穩定性并非單獨存在，而是緊密關聯——化學反應可能導致物理不穩定性，而物理不穩定性也會縮小能相互作用的殘基之間的距離，進而影響其化學性質。

2.1化學不穩定性

氧化，如二硫鍵的形成，是發生在抗體分子中最常見的化學反應之一。它既可以由氧化劑（如過氧化物、光或金屬）的存在導致，也可以自發產生。有一些殘基很容易被氧化，包括蛋氨酸、組氨酸和半胱氨酸殘基，二硫鍵的形成就是半胱氨酸氧化的結果之一。

蛋白質的另一個主要化學降解過程是脫酰胺化（天冬酰胺與谷氨酰胺）18。當該過程發生在天冬酰胺時，琥珀酰亞胺中間體能夠自發水解生成天冬氨酸或異天冬氨酸5。單克隆抗體也可能在二硫鍵或肽鏈上發生裂解。二硫鍵斷裂可導致抗體的片段化（如單鏈抗體）。肽鍵的斷裂可由酶或非酶機制引發并形成不同性質和大小的低分子量片段，鉸鏈區域也很容易發生切割13。

單克隆抗體化學修飾的影響在很大程度上取決于修飾發生的位置7。例如，Fc片段中的脫酰胺作用可能影響很小，而如果位于Fab片段的CDR中，則可能導致結合親和力和單抗效力的降低7。氧化也可能產生同樣的結果，如果位于Fc片段，可能降低與FcRn和巨噬細胞的結合親和力2。此外，一些研究表明，化學不穩定性會導致構象的改變和聚集12。例如Burkitt等人的研究顯示，蛋氨酸氧化易使二級結構穩定性降低3。

2.2物理不穩定

蛋白質的變性是指蛋白質的高級結構通過去折疊而喪失。這既可能是由于先前描述的化學不穩定性，也可能由環境條件，如極端溫度或pH值造成。聚集是主要的物理不穩定性10，由最初的天然蛋白質組裝成高分子量多聚體。聚集體由弱的非特異性鍵（范德華力、氫鍵、疏水性和靜電相互作用）組成，一級結構并不發生變化16。結果可導致可溶性或不溶性沉淀聚合物的形成。聚集往往是不可逆的，特別是在后期，聚集物往往含有高水平的非天然構象的蛋白質6.。

3.穩定性的影響因素

3.1蛋白質結構

蛋白質的各級結構都能對其穩定性產生影響。氨基酸序列對決定蛋白質是否容易聚集具有重要作用。例如，CDR的低等電點似乎通過增強單克隆抗體之間的靜電相互作用來促進可溶性多聚體的形成，而CDR的高等電點則優先導致不溶性聚集體的形成，特別是在與帶負電荷的表面接觸時8。

mAb序列和結構的細微變化也會顯著影響其在不同壓力條件下的穩定性。Pisupati等人在一項強制降解研究中比較了英夫利昔單抗（Remicade?）和其生物類似物（Remsima?）的性質，發現盡管產品的外形和制造工藝存在細微差異，但初級序列是影響穩定性的主要因素19。此外，殘基上的黏附物（如聚糖），特別是易聚集的黏附物，可能會降低整個mAb的聚集趨勢17。三級結構對聚集也有巨大的影響，這取決于展開的程度，因為一些研究表明，部分展開的蛋白質比天然和完全展開的蛋白質更容易發生聚集6。

3.2蛋白質濃度

高蛋白濃度已被證明會影響聚集。較高的蛋白質濃度似乎也會增加溶液的黏度，而溶液本身可能通過增強蛋白質之間的相互作用和自我結合來增加蛋白質的聚集潛能21，22。考慮到皮下給藥需要高濃度的單克隆抗體，這種依賴濃度的聚集趨勢是一個被日益關注的問題。

3.3溫度

高溫可以擾亂天然蛋白質的構象，促進聚集現象的出現，提高蛋白質的聚合速率6，甚至導致不可逆的構象變化16。

低溫可能引起蛋白質變性，特別是在冷凍和凍融循環過程中，這與多種壓力因素（結晶導致的緩沖液pH值下降、溶質分子低溫濃縮、水冰界面形成等）的組合有關，從而影響蛋白質的膠體和構象穩定性14。

3.4光

mAb藥物在制備過程中的許多階段都會暴露在光下。例如，生產過程中，通常用柱層析法純化，然后（短暫地）暴露于檢測器的紫外線下，在儲存和患者給藥期間是其主要暴露于光的階段。蛋白質，尤其是它們的芳香殘基，對光非常敏感，通過光氧化和氧自由基的形成誘導光降解，或者出現斷裂和交聯11。含有大量芳香殘基（尤其是色氨酸殘基）的抗體對這種現象特別敏感，由此證實了紫外線比白光的影響更大。液體形式似乎也比凍干形式更敏感9。不僅是單抗，配方中的輔料也可能發生光降解。多聚物的光降解通過自發氧化作用發生，并可導致過氧化物的形成，從而加劇氧化過程4，15，。

4.單抗穩定性的研究方法

單抗藥物的穩定性是一個比小分子藥物更復雜的問題，不能僅僅根據穩定的濃度或沒有降解產物來定義，還必須包括對不穩定性臨界點的完整評估20。應包括三個主要方面的評估：（1）物理穩定性：研究聚合、分裂以及抗體結構;（2）化學穩定性：檢測是否出現化學退化（如之前所述）;（3）生物穩定性：證實單抗在達到其理化穩定性時能夠保持其生物活性。這是一項具有挑戰性的工作，因為不同的測定評估方法可能會導致不一致的結果，例如在聚合測定過程中由不同技術度量范圍導致的測量結果不同16。

ICH生物技術產品穩定性評價指南給出了生物活性測定、分子實體分析和純度分析（降解產物定量檢測）。其他參數也應監測（例如視覺外觀、pH值等）。藥品評價應至少對3個不同批次進行20。歐洲已經發表了關于抗癌藥物穩定性研究的共識，特別是關于蛋白質藥物，包括單克隆抗體1。為了研究物理不穩定性，應該使用幾種正交技術，至少包括比濁法和SEC，但也推薦其他技術，如圓二色譜。為了研究化學不穩定性，至少使用3種分離技術，推薦使用離子交換色譜、SEC和肽圖分析。生物穩定性應采用免疫或細胞毒性測定法進行評估，但僅作為一種補充試驗，其結果不應被視為總體穩定性的自我證據，因為相同的生物活性并不意味著整個結構的完全一致1。

綜上所述，了解并建立對單抗藥物穩定性評價的機制對于其在臨床使用中達到更穩定的效果具有重要的實踐指導意義。

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