扶正化瘀膠囊抗肝纖維化作用研究

李厚鋼 郭有愛

【摘要】：目的：驗證30%CCL4模型能否被扶正化瘀膠囊與秋水仙堿治療，以及比較兩種藥物對肝纖維化的抑制能力。 方法：采用30%CCL4造肝纖維化模型，造模與給藥同時進行。80只小鼠隨機分成空白對照組、模型對照組、供試品扶正化瘀給藥組與陽性藥物秋水仙堿給藥組，空白對照組給0.9%氯化鈉注射液、模型對照組給30%CCL4、藥物組給相應(yīng)藥物，每周末處死模型對照組與空白對照組各1只，觀察肝組織病理改變、進食、存活和活動狀態(tài)，第4周末次給藥1小時后處死小鼠，取血和肝臟，全自動生化分析儀檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP），肝組織用于HE染色后觀察組織的病理學(xué)變化。結(jié)果：與空白對照組相比，CCL4組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)明顯破壞，肝細胞排列紊亂，炎性細胞侵潤程度增加;血清ALT、AST、ALP值均顯著升高（P<0.05）。扶正化瘀給藥組和秋水仙堿給藥組小鼠ALT、AST、ALP值與CCL4組相比較明顯降低;病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，秋水仙堿給藥組的肝纖維化減輕程度與扶正化瘀給藥組相當(dāng)，肝細胞排列恢復(fù)，小葉結(jié)構(gòu)輕度紊亂;一般情況觀察發(fā)現(xiàn)，扶正化瘀給藥組小鼠死亡率低于秋水仙堿給藥組。結(jié)論：扶正化瘀膠囊與秋水仙堿均能提高對肝纖維化的治療作用，但扶正化瘀膠囊相對更好。

【關(guān)鍵詞】： 扶正化瘀 抗肝纖維化 作用研究

《全球癌癥報告 2014 》顯示，中國新增和死亡病例世界第一，每年約 250 萬人死于癌癥（肝癌），占世界肝癌總死亡人數(shù)的 51%。由肝纖維化引起各種病因的慢性肝病導(dǎo)致患者中的 25%～ 40%最終惡化為肝硬化乃至肝癌。肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織中肝星狀細胞（HSC）增生導(dǎo)致肝內(nèi)細胞外基質(zhì)（ECM）過度沉淀的病理過程。肝纖維化細胞的特點：具有增殖性、纖維原性、可收縮性的肌成纖維樣細胞。本實驗室前期研究證明肝纖維化的進程是可逆的，但抗肝纖維化的作用機理未知。本實驗旨在研究扶正化瘀膠囊抗肝纖維化的作用機理，為后續(xù)課題組對抗肝纖維化作用機理研究提供一定的依據(jù)。

1實驗材料

1.1受試藥物及其配制方法

扶正化瘀膠囊：0.3g/粒，國藥準字Z20020073，批號：170109，上海黃海制藥有限責(zé)任公司。臨用前稱取扶正化瘀藥物粉末0.2925g溶于10ml溫水中即得。

30%CCL4：CCL4溶液與食用油按照3：7的比例混勻。

秋水仙堿：0.5mg/粒，國藥準字H20113208，批號：20161004，廣東彼迪藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。臨用前稱取0.2mg溶于10ml純水中，即得。

0.9%氯化鈉注射液：國藥準字H20043320，批號：161224510，武漢福星生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2實驗動物

SPF級KM小鼠，雄性，共96只，體重18～20克，由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司提供，實驗動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（鄂）2012-0013。

1.3實驗動物飼養(yǎng)管理環(huán)境

實驗動物飼養(yǎng)SPF級環(huán)境，實驗動物使用許可證：SYXK（鄂）2014-0009。自由飲用凈化水，光照為12h明暗交替，溫度為22～24℃，相對濕度50～70%。

2儀器與試劑

2.1試劑

10%中性甲醛、四氯化碳均購買于國藥集團化學(xué)試劑有限公司;谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）堿性磷酸酶（ALP）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;食用油為金龍魚食用油。

2.2儀器

石蠟切片機（Finesse E+，賽默飛世爾）;烤片機（High Capacity Dryer，賽默飛世爾）;包埋機（Histo Star，賽默飛世爾）;包埋盒打號機（Printmate 150，賽默飛世爾）;脫水機（Excelsior ES，賽默飛世爾）;動物秤（DS-671，上海金山亭衡衡器有限公司）;倒置熒光顯微鏡（BX53，OLYMPUS）;全自動生化分析儀（AU400，OLYMPUS）;臺式低溫高速離心機（3K15，德國SIGMA）。

3實驗方法

3.1動物分組與給藥

KM小鼠適應(yīng)環(huán)境5天后，按隨機數(shù)表法隨機分為空白對照組、模型對照組、扶正化瘀給藥組和秋水仙堿給藥組。除空白對照組給予0.9%氯化鈉注射液外，剩余小鼠均給予30%CCL4腹腔注射，造模與治療同時進行，灌胃體積20ml/kg，每周2次，共計4周。

實驗期滿，所有小鼠禁食不禁水12h，取血，分離血清并采集組織樣本。

3.2一般情況觀察

觀察小鼠進食、存活、活動狀態(tài)、毛色光澤度、排便等情況。

3.3病理形態(tài)觀察

蘇木精-伊紅染色（HE），觀察小鼠肝纖維化的程度，倒置熒光顯微鏡觀察肝組織切片的超微結(jié)構(gòu)。

從肝左葉中部切取厚度約2mm的肝組織，用10%中性甲醛固定。將固定好的肝組織依次放置于脫水機按照“70%乙醇3h，80%乙醇2h，90%乙醇2h，95%乙醇2h，100%無水乙醇（Ⅰ）30min，100%無水乙醇（Ⅱ）30min，二甲苯（Ⅰ）20min，二甲苯（Ⅱ）20min”的設(shè)定程序進行脫水，然后依次置于包埋機、包埋打號機中包埋染色、打號，于烤片機中烘干后用切片機切制厚度為5μm的切片。用Progres CapturePro2.8.8顯微圖像處理系統(tǒng)觀察并收集圖片，比較各組肝臟組織形態(tài)變化。

3.4肝功能生化檢測

小鼠取血后室溫靜置1h，12000r/min，離心10min，分離血清，用全自動生化分析儀檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）堿性磷酸酶（ALP）。

4統(tǒng)計學(xué)處理

計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，用SPSS16.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，不同組間比較采用單因素方差分析，P<0.05時，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

5結(jié)果

5.1一般情況觀察

空白對照組，小鼠活動正常，毛發(fā)有光澤，飲食量正常;模型組，小鼠活動減少，精神萎靡，毛發(fā)無光澤，尿液黃色，大便稀溏，有腹瀉，飲食量減少，小鼠喜歡縮在角落里;扶正化瘀給藥組與秋水仙堿給藥組小鼠活動程度、飲食量和毛發(fā)光澤程度均好于模型組;秋水仙堿給藥組小鼠給藥期間發(fā)生過小鼠廝打現(xiàn)象。實驗期間，空白對照組小鼠無死亡，死亡率0%;模型對照組小鼠死亡9只，死亡率37.5%;扶正化瘀給藥組小鼠死亡2只，死亡率8.3%;秋水仙堿給藥組小鼠死亡9只，死亡率37.5%。為方便統(tǒng)計學(xué)統(tǒng)計，各組均取10只小鼠進行相關(guān)指標的檢測。

5.2肝病理形態(tài)觀察

空白對照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細胞多呈單核，以中央靜脈為中心呈放射狀排列;肝纖維化模型組小鼠肝小葉有大量的炎性細胞;扶正化瘀給藥組和秋水仙堿給藥組與肝纖維化模型組相比，其纖維化程度明顯減輕，炎性細胞侵潤程度減小，與空白對照組相比，其肝纖維化程度明顯增強，表現(xiàn)為肝細胞排列紊亂，細胞和有炎性細胞侵潤;扶正化瘀給藥組與秋水仙堿給藥組肝纖維化程度相比較，秋水仙堿給藥組纖維化程度明顯減輕，表現(xiàn)為肝小葉結(jié)構(gòu)輕度紊亂、排列恢復(fù)。

A：CCL4組;B：模型組;C：扶正化瘀組;D：秋水仙堿組

5.3血清生化學(xué)指標檢測

血清生化學(xué)結(jié)果顯示（表1），肝纖維化模型組（CCL4組）較空白對照組ALT、AST、ALP值顯著升高（P<0.05）;扶正化瘀給藥組和秋水仙堿給藥組與肝纖維化模型組相比ALT、AST、ALP值明顯下降，存在顯著差異（P<0.05）;扶正化瘀給藥組與秋水仙堿給藥組的ALT、AST、ALP值相比雖然低但不存在顯著差異，無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

6討論

本實驗采用30%CCL4制備小鼠肝纖維化模型， CCL4模型是一種典型的制備肝纖維化模型方法，具有耗時短的特點。造模成功后可見肝細胞以及血清生化指標發(fā)生顯著變化，ALT、AST、ALP是用于反映肝功能損傷或健康程度的基本指標，大量文獻中使用ALT、AST、ALP的頻率遠高于其他指標。

有文獻將體重或肝指數(shù)作為檢測指標，我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，CCL4與油混用后，經(jīng)過腹腔注射、皮下注射和灌胃后，油的成分均有滯留在動物體內(nèi)的現(xiàn)象，使動物體重不同程度的增加。因此，我們認為將體重或肝指數(shù)作為檢測指測指標不具有研究意義。

有文獻報道小鼠肝纖維化模型制備后，存在一定的自愈傾向。為了驗證這一結(jié)論，我們額外增加了一項預(yù)實驗，另取18只KM小鼠，分為空白對照組、模型對照組和自愈組，空白對照組給0.9%氯化鈉，模型對照組給30%CCL4，除自愈組在第4周末次給藥后保留外，剩余兩組全部處死，取肝組織固定保存，自愈組每繼續(xù)經(jīng)過1周處死一只，觀察肝組織形態(tài)變化。發(fā)現(xiàn)在制備模型成功后，肝纖維化小鼠存在極弱的自愈能力，小鼠的肝組織形態(tài)幾乎無變化。

秋水仙堿作為西藥中的合成藥物，作用見效快，但死亡率高，不利于肝纖維化治療的用藥安全。中藥是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，按中醫(yī)治療原則使用的貨真質(zhì)優(yōu)的藥材，包括中藥材、中藥飲片和中成藥。隨著中醫(yī)、針灸在西方世界的發(fā)展，中藥也受到了青睞。相對于毒副作用高的西藥，中藥毒副作用小、開發(fā)潛力巨大，但其作用機理的闡明仍需繼續(xù)研究。

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作者簡介：

1、李厚鋼（1988年-），男，漢族，隨州，碩士，藥師，湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院，主要從事中藥資源與開發(fā)的研究。

2、郭有愛（1964年-），女，漢族，隨州，工程師，大學(xué)本科，長江職業(yè)學(xué)院。