BAG-1過表達對卵巢癌紫杉醇耐藥性的研究

王琮 楊少玲

[摘要]目的：證明BAG-1過表達與紫杉醇耐藥有關。方法：通過血清饑餓實驗和DNAladder實驗檢測卵巢上皮性癌對環境和紫杉醇反應的差異;western=blot法檢測紫杉醇孵育24H后SKOV-3細胞BAG。1，BCL-XL和凋亡相關蛋白的表達。結果：SKOV-3細胞對低營養環境或紫杉醇耐受能力較正常卵巢上皮細胞高;紫杉醇孵育24H后SKOV-3細胞BAG-1表達仍比卵巢上皮細胞高，BCL-2和BCL-XL仍有類似現象，但在所有濃度孵育下卵巢上皮細胞HOSEpiC和最高濃度孵育下的SKOV-3細胞未檢測BCL-2表達，DNA損傷標記蛋白γH2AX表達在SKOV-3細胞中較卵巢上皮細胞低。結論：BAG-1在SKOV-3細胞中表達上調，其作用機制與BCL-xL有關。

[中圖分類號]R737.31 [文獻標識碼]A [文章編號]2096-5249（2019）05-008-01

1背景

來源于卵巢組織的惡性腫瘤是世界七大癌癥之一，每年新發病例中約有80%以上病例為Ⅲ期IV期，較早出現遠處轉移。近二十年，卵巢癌發病率雖有所下降，死亡率卻是仍居高不下。隨著卵巢癌腫瘤細胞減滅術廣泛應用、紫杉醇等一線化療藥物的應用及分子生物學手段日新月異，I期患者生存率有了顯著提高，五年生存率能達到90%左右。HI/IV期患者通常經過約兩年時間治療，多數病例出現復發或耐藥，因此五年存活率僅有25-30%。多步驟、多因素、多種關鍵分子或信號通路所致，通過影響卵巢癌細胞周期調控、增殖、遷移和侵襲，促進卵巢癌的發生發展。紫杉醇的引入是治療卵巢癌的重要里程碑。然而部分患者對紫杉醇反應較差，這引起科研工作者對紫杉醇作用機制的深入研究，以改善患者生存率。

2材料和方法

2.1細胞培養與分組

卵巢上皮細胞HOSEplC，人卵巢癌細胞株SKOV-3置于含10%新生牛血清的RPMI 1640培養液中常規（37℃，5%C02）培養。2-3.d傳代1次。取對數生長期SKOV3卵巢癌細胞，卵巢上皮細胞HOSEplC用于本部分實驗。

2.2細胞培養 人卵巢癌細胞株SKOV-3、卵巢上皮細胞HOSEpiC均購自于北京協和醫院細胞庫。

取對數生長期的SKOV3、HOSEplC細胞用于實驗。

2.3血清饑餓實驗 使用不同濃度血清（10%，8%，6%，4%，2%，0%）對SKOV-3和HOSEpiC分別培養72.h，并使用MTT法檢測細胞活性。

結果：如圖1所示，SKOV-3細胞在低濃度血清培養基中活性高于同濃度培養條件下的HOSEpiC。

2.4DNALadder檢測凋亡 結果：如圖2所示，（1）同濃度順鉑孵育后，HOSEplC細胞DNA斷裂較SKOV-3明顯;（2）HOSEplC和SKOV-3的DNA斷裂情況有紫杉醇劑量依賴性;（3）HOSEpiC細胞在最低紫杉醇濃度（1uM）孵育下較最高濃度（10uM）孵育的SKOV-3仍然有更強的DNA斷裂現象。

2.5順鉑作用后BAG-1與BCL-2蛋白家族表達 使用不同紫杉醇濃度孵育兩株細胞24.h，Western=Blot法檢測BAG-1、BCL-xL、BCL-2和磷酸化γH2AX表達水平。

3結果

如圖3所示，（1）24.h順鉑孵育后SKOV-3細胞BAG-1表達較所有濃度順鉑孵育下的HOSEplC表達水平高，其中BAG-1M在HOSEplC。中表達量極低;最高濃度順鉑孵育后SKOV-3細胞的BAG-1表達較其他濃度有所降低。但仍比HOSEpiC細胞表達量高;（2）BCL-xL在SKOV-3細胞表達隨順鉑濃度增加而表達增加，但在最高順鉑濃度組表達略有降低，BCL-xL蛋白在HOSEpiC細胞中隨順濃度增高略有降低;（3）在HOSEplC細胞中未檢測到BCL-2蛋白表達，在SKOV-3細胞中BCL-2表達隨順鉑濃度增加遞減，在最高順鉑濃度10uM未被檢測到;

（4）磷酸化γH2AX表達水平在HOSEpiC細胞中明顯高于同濃度順鉑孵育的SKOV-3細胞。

4討論

紫杉醇是各種癌癥化學治療的一線藥物，近年來卵巢癌靶向治療藥物發展迅速但仍需聯合紫杉醇治療。紫杉醇耐藥是影響HNSCC治療療效的最大障礙，本研究所選細胞的耐藥性通過體外低劑量紫杉醇誘導產生，因此所選耐藥細胞更能體現臨床患者的實際情況，與其對應原發腫瘤細胞比較更有價值。

對于紫杉醇耐藥機制已經有諸多研究并找到許多生物標記物，但是這些標記物并不是在所有癌癥中表達，并且許多標記物在紫杉醇耐藥中的作用顯示出相互矛盾的數據。迫其原因可能是因為紫杉醇的作用機制與耐藥機制是多層次、多因素的，癌癥類型、分期、患者自身因素等導致不同的癌癥信號通路被激活。在一個患者中可能有多種耐藥機制激活，顯然一個生物標記物對于癌癥的研究信息是不足夠。我們使用血清饑餓實驗結合Westem Blot等傳統實驗技術得出BAG-1高表達可能是部分HNSCC患者產生順鉑耐藥性的重要原因。