鋅指蛋白mA20突變體對(duì)內(nèi)毒素性肺泡巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用

左云龍 黨潤(rùn) 彭紅艷 武志遠(yuǎn) 楊鎰?dòng)?/p>

[摘要]目的：探討鋅指蛋白mA20突變體對(duì)內(nèi)毒素性肺泡巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用;方法：分別設(shè)立A：NS對(duì)照組，B：空白脂質(zhì)體處理組，C：脂質(zhì)體+綠色熒光蛋白質(zhì)粒處理組，D：脂質(zhì)體+綠色熒光蛋白。鋅指蛋白mA20突變體質(zhì)粒處理組;按文獻(xiàn)制備脂質(zhì)體/GFP質(zhì)粒復(fù)合物、脂質(zhì)體/GFP-鋅指蛋白mA20質(zhì)粒突變體復(fù)合物，分別處理C、D組;結(jié)果：4組的內(nèi)毒素性肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)及IL-1B相比差異具有顯著性（P>0.05）;將攜帶mA20基因的病毒載體轉(zhuǎn)染肺泡巨噬細(xì)胞（mA20過(guò)表達(dá)肺泡巨噬細(xì)胞），感染后，可在熒光顯微鏡下觀(guān)察到綠色熒光;結(jié)論：內(nèi)毒素性ALI的難題與根本問(wèn)題就是炎癥級(jí)聯(lián)效應(yīng)，而改善此類(lèi)患者的有效措施就是阻斷炎癥級(jí)聯(lián)效應(yīng)的通路，鋅指蛋白mA20突變體在通路中具備較好的阻斷作用。

[關(guān)鍵詞]鋅指蛋白mA20突變體;內(nèi)毒素性肺泡巨噬細(xì)胞;調(diào)控作用

[中圖分類(lèi)號(hào)]R72 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]2096-5249（2019）05-016-02

急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征（acute lung injury/acute respiratorydistress syndrome，ALI/ARDS）系指患者在承受各種病理性刺激反應(yīng)在之后誘發(fā)急性炎癥，主要的臨床癥狀是缺氧及呼吸困難。鋅指蛋白mA20主要發(fā)揮炎癥調(diào)控的作用，是機(jī)體中非常重要的內(nèi)源蛋白，能夠有效抑制NF-B，如此便能夠有效改善炎癥細(xì)胞因子的“瀑布樣”級(jí)聯(lián)癥狀。現(xiàn)今，分子生物學(xué)水平漸漸提升，本文基于此，深入探究鋅指蛋白mA20對(duì)內(nèi)毒素性ALI時(shí)肺組織保護(hù)性機(jī)理，以期為ALl的防治奠定堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)及理論基礎(chǔ)。

1材料

1.1質(zhì)粒的準(zhǔn)備 ①依照《分子克隆》自制JMl09感受態(tài);②GFP及mA20質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化測(cè)驗(yàn);③GFP及mA20質(zhì)粒擴(kuò)增、提取，瓊脂糖凝膠電泳鑒定;④憑借酶切及連接的手段，制備表達(dá)富含GFP-mA20突變體的融合蛋白，并且進(jìn)行擴(kuò)增，展開(kāi)瓊脂糖凝膠電泳及測(cè)序鑒別。④內(nèi)毒素選擇中劑量（2.5mg/kg）。

1.2支氣管肺泡灌洗 所有研究大鼠均展開(kāi)肺泡灌洗，并且依照分離、純化、貼壁、分裝的次序進(jìn)行培養(yǎng)。研究分組主要分成三組，分別是高劑量（5mg/kg）、中劑量（2.5mg/kg）、低劑量（0.5mg/kg），并且以分組的方式攻擊SD大鼠PAM;形成各個(gè)濃度范圍內(nèi)的毒素性PAM細(xì)胞模型。

1.3純化、培養(yǎng)皿分裝培養(yǎng) 設(shè)置A：NS對(duì)照組，B：空白脂質(zhì)體處理組，C：脂質(zhì)體+綠色熒光蛋白質(zhì)粒處理組，D：脂質(zhì)體+綠色熒光蛋白-鋅指蛋白mA20突變體質(zhì)粒處理組;依照相關(guān)研究自制脂質(zhì)體/GFP-鋅指蛋白mA20質(zhì)粒突變體復(fù)合物、脂質(zhì)體/GFP質(zhì)粒復(fù)合物，并針對(duì)C、D組分別采取處理。

1.4觀(guān)察指標(biāo) 將PAM培養(yǎng)的上清液采集，ELISA針對(duì)Ⅱ-1及TNF-α的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè);運(yùn)用熒光顯微鏡測(cè)定采集的細(xì)胞，利用綠色熒光的特征性反應(yīng)，區(qū)別質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的狀況;IL-1及TNF-α引物設(shè)計(jì)，憑借RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增進(jìn)而得到目標(biāo)片段，瓊脂糖凝膠電泳鑒定;憑借Tripure試劑獲得PAM總RNA，RT-PCR，擴(kuò)增得到首條cDNA。

1.5質(zhì)量控制 研究大鼠均選擇清潔型SD大鼠，并且由專(zhuān)業(yè)人士根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)與分子生物學(xué)的流程開(kāi)展研究;為能夠有效提升基因轉(zhuǎn)染率，憑借新型陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)基因進(jìn)行AM的轉(zhuǎn)入操作;運(yùn)用進(jìn)口試劑進(jìn)行測(cè)試，保障數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可靠性;重復(fù)進(jìn)行5-10次實(shí)驗(yàn)，降低了結(jié)果誤差，測(cè)試重復(fù)性也較好。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示數(shù)據(jù)，并且憑借spss軟件展開(kāi)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，最終運(yùn)用條形圖、線(xiàn)形圖、熒光顯微鏡圖片以及表格等展示測(cè)試結(jié)果。

2結(jié)果

4組的內(nèi)毒素性肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)相比差異具有顯著性（P<0.05），見(jiàn)表1.4組肺組織勻漿IL-1B測(cè)定結(jié)果相比差異具有顯著性（P<0.05），見(jiàn)表2.將攜帶mA20基因的病毒載體轉(zhuǎn)染肺泡巨噬細(xì)胞（mA20過(guò)表達(dá)肺泡巨噬細(xì)胞），圖分別為感染3h、6h、12h、24h后的情況。見(jiàn)圖。

將攜帶mA20基因的病毒載體轉(zhuǎn)染肺泡巨噬細(xì)胞（mA20過(guò)表達(dá)肺泡巨噬細(xì)胞）。感染后?？稍跓晒怙@微鏡下觀(guān)察到綠色熒光。見(jiàn)下圖

3討論

3.1目前研究現(xiàn)狀和存在問(wèn)題 目前防治內(nèi)毒素性ALI的根本難題是不能有效的控制炎癥因子的“級(jí)聯(lián)放大”的瀑布樣反應(yīng)，導(dǎo)致肺損傷加重，最終誘發(fā)或加重多臟器功能障礙綜合征（MODS）。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究主要集中在如下幾方面：①常規(guī)用各種機(jī)械通氣的方法支持治療，但在沒(méi)解決感染的根本問(wèn)題時(shí)，該方法的遠(yuǎn)期效果不理想，而且還容易帶來(lái)高氧肺損傷的并發(fā)癥;②也有眾多學(xué)者采用抗免疫療法，雖取得了很大的進(jìn)展，但由于治療時(shí)機(jī)、抗炎抑炎的平衡難以把握，抑炎措施單一，致使有相當(dāng)部分效果不甚明顯，ALI/ARDS病死率仍無(wú)顯著改善;③雖然抗生素治療是有效的措施，但隨著藥物的濫用，出現(xiàn)了相當(dāng)多的耐藥細(xì)菌。這使得抗生素的使用遇到很尷尬的境地;④外源性肺表面活性物質(zhì)（PS）的替代療法是近來(lái)較為先進(jìn)的治療措施，但由于劑型、給藥途徑不一，操作較煩瑣以及費(fèi)用較為昂貴等原因，使得PS替代療法難以廣泛應(yīng)用;⑤化痰藥、擴(kuò)血管藥物的應(yīng)用只能對(duì)癥支持，不能有效解決根本的炎癥問(wèn)題;還常常會(huì)由于多數(shù)擴(kuò)血管藥物缺乏對(duì)肺循環(huán)的選擇性作用而加重低氧血癥;⑥蛋白酶抑制劑的應(yīng)用對(duì)ALI的治療效果仍有爭(zhēng)議。⑦臨床中多用的抗氧化治療也只是個(gè)輔助措施。

回顧以往的研究多集中在如何抗感染、保護(hù)肺功能、對(duì)癥支持以及輔助治療，多是很“被動(dòng)”的措施，而對(duì)如何從根本上阻斷ALl炎癥反應(yīng)通路的研究甚少。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，在分子水平上對(duì)炎癥反應(yīng)進(jìn)行合理調(diào)控成為當(dāng)前熱點(diǎn)。

3.2鋅指蛋白mA20突變體是新型結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的炎癥調(diào)控物質(zhì)目前。社會(huì)各界非常注重免役源性因素，例如趨化因子、細(xì)胞因子、炎癥細(xì)胞在內(nèi)毒素性ALI時(shí)炎癥反應(yīng)階段中所發(fā)揮的調(diào)控作用，雖然能由基因?qū)哟斡行д{(diào)控炎癥反應(yīng)，可是對(duì)內(nèi)毒素性ALl炎癥反應(yīng)階段中的特定位點(diǎn)運(yùn)用某一內(nèi)源性調(diào)控蛋白而開(kāi)展的試驗(yàn)及研究鮮少。已經(jīng)有相關(guān)研究證實(shí)鋅指蛋白mA20是一種胞漿炎癥調(diào)控蛋白。并且根據(jù)有關(guān)報(bào)道可知鋅指蛋白mA20是胞液內(nèi)的泛素修飾蛋白。能夠表現(xiàn)出負(fù)調(diào)控NF-B的效果，在負(fù)調(diào)控炎癥中尤為關(guān)鍵。針對(duì)mA20基因功能及結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的探究之后得知：mA20功能結(jié)構(gòu)域共有兩個(gè)。分別是mA20的C末端半?yún)^(qū)（386-775）及N末端半?yún)^(qū)（1-385）;C半?yún)^(qū)是鋅指區(qū)，Cys2/Cys2型鋅指的數(shù)量有7個(gè)，并且結(jié)構(gòu)均是重復(fù)的。設(shè)置了mA20突變體表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染炎癥細(xì)胞模型，得知mA20對(duì)NF-B活性抑制和C半?yún)^(qū)中ZnF存在較為密切的關(guān)聯(lián)性，并且若是突變體存在ZnF不少于4個(gè)，對(duì)NF-B活性所發(fā)揮的抑制效果幾乎等同于存在7個(gè)ZnF野生型mA20.可是根據(jù)相關(guān)報(bào)道可知mA20的N端卵巢腫瘤（OUT）域存在較強(qiáng)的去泛素化活性，并且此信號(hào)與NF-B信號(hào)的抑制效果并不存在關(guān)聯(lián)性，此外，這兩個(gè)信號(hào)可以證實(shí)mA20可以使得被多泛素化的RIPl有效消除，這也是在7NF介導(dǎo)過(guò)程中NF-B活化抑制效果的體現(xiàn)。另外，在轉(zhuǎn)染測(cè)試過(guò)程中野生型mA20會(huì)對(duì)RIPl產(chǎn)生促進(jìn)作用，并且會(huì)因此出現(xiàn)穩(wěn)定性顯著降低的結(jié)果。mA20與RIPl去泛素化、再泛素化之間存在較為密切的關(guān)聯(lián)性，如此便能抑制NF-B，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗炎效果。

3.3鋅指蛋白A20突變體防治內(nèi)毒素性ALl的可能機(jī)制 肺巨噬細(xì)胞（PAM）是LPS攻擊進(jìn)而誘發(fā)急性肺受損的一種重要效應(yīng)細(xì)胞，由于PAM在LPS存在的條件下釋放IL-1、TNF-α、前列腺素（PG）、IL-8、IL-6、補(bǔ)體C3等炎癥介質(zhì)，進(jìn)而誘發(fā)嚴(yán)重的炎癥“級(jí)聯(lián)”瀑布樣效應(yīng)。野生型mA20現(xiàn)今已經(jīng)證明是NF-B的負(fù)調(diào)控胞內(nèi)蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致下游轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生的各項(xiàng)炎癥因子水平降低，實(shí)現(xiàn)抗炎目標(biāo)。但是mA20突變體是不是可以對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)PAM活化階段過(guò)程中的級(jí)聯(lián)放大“瀑布樣”效應(yīng)產(chǎn)生有效的阻隔作用，現(xiàn)在并沒(méi)有相關(guān)研究可以證實(shí)。

本組資料顯示，4組的內(nèi)毒素性肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)、肺組織勻漿IL-1B測(cè)定結(jié)果以及肺組織勻漿TNF alpha測(cè)定結(jié)果相比差異均具有顯著性（P<0.05）。簡(jiǎn)而言之，內(nèi)毒素性ALI的難題與根本問(wèn)題就是炎癥級(jí)聯(lián)效應(yīng)，而改善此類(lèi)患者的有效措施就是阻斷炎癥級(jí)聯(lián)效應(yīng)的通路，鋅指蛋白mA20突變體在通路中具備較好的阻斷作用。