DNA測序技術(shù)原理、應(yīng)用與發(fā)展

摘 ?要：核酸是生命體的基本遺傳物質(zhì)，想要探究遺傳的奧秘，需要從基因組出發(fā)進(jìn)行探究，而DNA測序技術(shù)就能為這一類研究提供途徑。隨著科學(xué)的進(jìn)步，測序技術(shù)從第一代發(fā)展至第三代，甚至第四代測序也開始起步。本文簡要綜述了測序技術(shù)的發(fā)展歷程、應(yīng)用及其發(fā)展趨勢，重點(diǎn)討論了幾種測序技術(shù)的原理。

關(guān)鍵詞：測序技術(shù);發(fā)展歷程;原理;應(yīng)用與發(fā)展

1測序技術(shù)的發(fā)展歷程

自Watson和Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以來，生物學(xué)的研究逐漸深入到分子水平，DNA測序技術(shù)一步步發(fā)展，并且功能愈多、通量愈高，成本也迅速降低。Whitfeld使用化學(xué)毒素和同位素通過層析法進(jìn)行多聚核苷酸測序。Sanger發(fā)明了雙脫氧核苷酸末端終止測序法。Maxam和Gilbertt提出了化學(xué)降解法。后來，熒光標(biāo)記技術(shù)取代同位素標(biāo)記技術(shù)，產(chǎn)生了自動化測序技術(shù)。同時(shí)期出現(xiàn)了雜交測序技術(shù)。能同時(shí)進(jìn)行合成與測序的454測序技術(shù)的出現(xiàn)，標(biāo)志著的二代測序技術(shù)的誕生。新一代的測序技術(shù)還包括了Solexa測序技術(shù)、SOLiD測序技術(shù)、Complete Genomics測序方法和半導(dǎo)體測序技術(shù)。緊接著，以單分子測序?yàn)橹饕攸c(diǎn)的第三代測序技術(shù)出現(xiàn)。2012年出現(xiàn)了納米孔單分子測序技術(shù)、電子顯微鏡觀察法等第四代測序技術(shù)。

2幾代測序技術(shù)的基本原理

2.1第一代測序技術(shù)

Sanger發(fā)明了雙脫氧核苷酸末端終止測序法，引入雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），使用四種添加了放射性同位素標(biāo)記的ddNTP，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過放射自顯影可根據(jù)判斷片段的大小和排序，確定整個(gè)片段的序列。

Maxam和Gilbertt提出化學(xué)降解法，使用32P對DNA鏈的5’端進(jìn)行放射性標(biāo)記，利用特殊化學(xué)方法修飾降解，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離片段后通過放射性自顯影技術(shù)判斷被標(biāo)記的DNA斷裂末端的堿基，達(dá)到測序目的。

雜交測序技術(shù)使用待測的變性DNA與已知的單鏈核苷酸進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交情況進(jìn)行序列的排列，得到測序結(jié)果。

2.2第二代測序技術(shù)

二代測序技術(shù)通量高，成本也低。Solexa測序技術(shù)（illumina測序儀）的核心原理是邊合成邊測序，核心技術(shù)是DNA簇和可逆終止化學(xué)反應(yīng)。在構(gòu)建測序文庫后，在隨機(jī)斷裂形成的DNA片段兩端加上已知序列接頭，進(jìn)行橋式擴(kuò)增，在含有基片的流通池內(nèi)能夠形成橋式結(jié)構(gòu)。再經(jīng)過30輪擴(kuò)增后，基片上形成單克隆DNA簇。最后加入熒光可逆終止的四種dNTP和改造的DNA合成酶進(jìn)行合成反應(yīng)，通過機(jī)器檢測熒光信號，測出核苷酸的序列，而dNTP上的熒光基因最終被化學(xué)切割、洗去。

454測序技術(shù)利用焦磷酸測序法，使用的是乳液PCR擴(kuò)增單拷貝DNA片段的微球，而微球置于微孔板中于流通池內(nèi)進(jìn)行測序。

SOLID技術(shù)的核心是連接反應(yīng)。構(gòu)建文庫，進(jìn)行乳液PCR擴(kuò)增，富集并沉積磁珠。以8堿基單鏈熒光探針混合物為連接的底物，引物與文庫模板的P1接頭序列雜交，四色熒光標(biāo)記的雙堿基探針與測序引物連接，進(jìn)行循環(huán)連接檢測和切割，達(dá)到測序目的。

Complete Genomics測序在構(gòu)建文庫時(shí)由于兩端加了接頭，形成環(huán)狀DNA模板，拷貝序列是類似滾環(huán)的擴(kuò)增方式，形成單克隆DNA納米球（DNB），利用錨定序列與探針的鏈接確定熒光信號測序。

半導(dǎo)體測序技術(shù)利用高密度半導(dǎo)體芯片檢測dNTP聚合時(shí)產(chǎn)生H+的變化，實(shí)時(shí)進(jìn)行測序，該法測序的靈敏度較高。

2.3第三代測序技術(shù)

堿基經(jīng)過納米級別的蛋白孔洞會產(chǎn)生跨膜電導(dǎo)率，可作為測序的依據(jù)，第三代測序技術(shù)就是建立在納米孔基礎(chǔ)上的技術(shù)。具有代表性的基于零級波導(dǎo)的SMRT系統(tǒng)測序核心在于觀測DNA聚合。聚合酶催化單個(gè)帶有熒光基團(tuán)的核苷酸連接，在芯片小孔檢測區(qū)內(nèi)激發(fā)出熒光信號從而實(shí)現(xiàn)測序。

此外，還有tSMS單分子測序技術(shù)以及VisiGen測序技術(shù)。

2.4第四代測序技術(shù)

第四代測序技術(shù)的主要思想是直接讀取DNA序列信息，目前有納米孔單分子測序技術(shù)和電子顯微鏡觀察法等方法，處于起步階段，尚待研究。

3應(yīng)用與發(fā)展

第一代測序技術(shù)問世后，人們開始進(jìn)行人類DNA序列測定，絕大部分DNA序列都是基于Sanger測序獲得的，而毛細(xì)管電泳測序方法促進(jìn)了人類基因組計(jì)劃的完成。

第二代測序技術(shù)的發(fā)展，極大的加速了基因組測序、宏基因組測序、DNA甲基化測序、轉(zhuǎn)錄組測序、目標(biāo)基因組區(qū)域再測序、基因的表觀遺傳修飾檢測、微生物檢測等領(lǐng)域的研究工作。其中，二代測序技術(shù)在腫瘤檢測方面甚至其他疾病的治療上有巨大的潛力。

第三代測序技術(shù)主要用于基因組測序、甲基化研究、突變鑒定（SNP檢測）等方面，為一些變異快的微生物引起的疾病提供治療策略，幫助人們更好地了解生命的發(fā)育過程和疾病的發(fā)生機(jī)制，也為生物學(xué)和功能方面的應(yīng)用開辟新道路。

從測序技術(shù)的發(fā)展來看，DNA測序技術(shù)以生物學(xué)為基礎(chǔ)，不斷融入化學(xué)、物理、計(jì)算機(jī)等學(xué)科，并且無一例外地以、提高測序通量與讀長、降低測序成本為目標(biāo)，不斷前進(jìn)發(fā)展。相信不久后千元基因組甚至百元基因組的目標(biāo)將會實(shí)現(xiàn)。屆時(shí)，人們在分子水平的研究又會更上一層樓。

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作者簡介：李瑜，華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，510000，1998.08，女，漢族，廣東省興寧市，本科在讀。