枸骨IcFPS1基因的克隆、表達及生物信息學分析

馬良瓊 曾慧 羅彩霞 張威威 許鋒 程水源

摘要：法尼基焦磷酸合酶（farnesyldiphosphatesynthase，FPS）是三萜皂苷生物合途徑的一個關鍵酶，為研究FPS基因在枸骨中的功能，該研究采用PCR技術將一個FPS基因的cDNA序列從枸骨葉中分離出來，并命名為IcFPS1。結果表明：根據測序結果分析發現擴增獲得的IcFPS1基因cDNA長度為1591bp，包含一個完整的開放閱讀框，大小為1029bp。通過序列分析發現枸骨IcFPS1基因編碼342個氨基酸，分子量和等電點分別為39.58kDa和5.18。通過理化性質預測分析發現IcFPS1蛋白不含信號肽，不含有跨膜區域，該IcFPS1蛋白為親水性蛋白質。通過序列多重比對發現IcFPS1蛋白質與其他植物的FPS蛋白質高度同源，有共同的保守區域和氨基酸序列，其中與西洋參FPS序列的相似性高達89%。通過系統進化樹分析發現枸骨FPS蛋白與同屬于被子植物的五加科植物FPS蛋白親緣關系較近，說明FPS基因在進化過程中相對比較保守。根據蛋白調控網絡預測分析結果發現該蛋白可能與IPP1、IPP2、GGPS3、GGPS6和ERA1相互作用，參與類異戊二烯的合成代謝過程。通過實時熒光定量PCR分析發現IcFPS1基因在枸骨各個組織部位中均有表達，其中在枸骨根中表達量最高，在莖和雌花中表達量最低。

關鍵詞：枸骨，法尼基焦磷酸合酶，三萜皂苷，克隆，表達

中圖分類號：Q943

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2019）03-0328-08

枸骨（Ilexcornuta）為冬青科灌木或喬木，四季常青，可用于綠化。同時，枸骨在傳統上也是常用中藥之一，枸骨根、葉、果實等組織均可入藥，在常見病痛治療方面有較好療效（彭國全等，2011）。根據《本草拾遺》記載，枸骨葉具備清熱養陰、補肝益腎、祛風濕等功效，在肺癆咳嗽、勞傷失血等疾病治療方面也有很好的應用（左文健等，2011）。枸骨葉中含有許多次生代謝物質，包括三萜及其皂苷、黃酮及其多酚類化合物（李國文等，2011）。因此枸骨具有重要的商業和藥用價值。

枸骨葉中主要成分之一的三萜皂苷是廣泛分布于人參、靈芝、三七、墨旱蓮等藥用植物中的一類重要次生代謝產物，屬于中藥植物的主要活性成分之一，具有抗癌、抗氧化、消炎解毒等功效（張召寶等，2015）。整個三萜生物合成過程涉及法尼基焦磷酸合酶、鯊烯合酶、鯊烯環氧酶或單加氧化酶、氧化鯊烯環化酶等一系列酶的催化。法尼基焦磷酸合酶（farnesyldiphosphatesynthase，FPS）是一種異戊烯基轉移酶，它催化五碳原子的二甲丙烯基焦磷酸和異戊烯基焦磷酸以頭尾連續縮合反應，進而形成碳原子的法尼基焦磷酸，成為植物體內皂苷、倍半萜、甾體、橡膠等許多萜類衍生物質的合成前體（Cunilleraetal.，1996）。至今，在洋甘菊（楊秀梅，2013）、擬南芥（Cunilleraetal.，1996）、刺五加（周秘等，2013）、絞股藍（蔣東等，2014）、三七（陳莉等，2006）等許多植物中已經進行了FPS基因的分離和功能研究，研究結果證實FPS是植物三萜皂苷生物合成途徑的一個關鍵酶，能夠調控植物類異戊二烯途徑，促進三萜皂苷的合成。截至目前，在枸骨上尚且沒有發現FPS基因的研究報道，克隆FPS基因并進行功能研究是揭示FPS基因在枸骨三萜生物合成途徑中功能的前提。在本項目中，我們對枸骨FPS基因進行了克隆、對其序列進行了生物信息學分析、并進行了組織表達分析。研究結果可為弄清FPS基因在枸骨三萜類生物合成中的調節作用奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

本研究中的枸骨材料采摘于長江大學校園，收集五種不同的組織（根、莖、葉、雄花、雌花）用于RNA提取和基因表達分析，采摘的材料立即在液態氮中速凍并儲存在-80℃超低溫冰箱中待用。

1.2方法

1.2.1RNA的提取和cDNA合成將枸骨的不同器官（根、莖、葉、雄花、雌花）在液氮中磨成細粉末狀，參照PlantRNAExtractionKit（TaKaRa，MiniBEST）試劑盒說明書提取各組織總的RNA。分光光度計和瓊脂凝膠電泳檢測質量較好的RNA用于cDNA的合成。枸骨cDNA的合成以RNA為模板，采用PrimeScriptTM的cDNA反轉錄試劑盒（TaKaRa，Dalian，China）完成。

1.2.2枸骨IcFPS1基因的克隆根據枸骨的轉錄組測序數據設計并合成FPS基因擴增特異引物，上游引物為IcFPSF1：5′-ATTAAGACCATCTGTGGAGCCTAGC-3′，下游引物為IcFPSR1：5′-GGGTGACAGGTTTGTATAGCATCCA-3′。PCR反應體系25μL，包括ddH2O16.5μL，10×Buffer2.5μL，MgCl22.0μL，dNTP0.5μL，上下游引物各1μL，cDNA模板1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL。PCR反應條件：94℃預變性4min;94℃變性30s，58℃退火40s，72℃延伸90s，共32個循環;最后72℃延伸10min，4℃結束。PCR擴增結果用1%的凝膠電泳檢測，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化擴增產物，純化產物連接到從寶生物購買的pMD19-T載體上，并轉化到DH5α感受態細胞中。轉化后的感受態細胞經活化蘇醒后被均勻地涂抹于含有Amp的LB的培養皿中，挑取菌落進菌液活化，并進行菌液PCR擴增驗證，陽性結果菌液送往上海生物工程公司進行測序。

1.2.3生物信息學分析IcFPS基因cDNA序列和蛋白質序列比對利用在線工具NCBI-blast（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BlAST/）完成。運用VectorNTISuitev11.5和DNAMAN8來分析IcFPS1基因的cDNA序列，進行蛋白質翻譯。IcFPS1蛋白質理化學性質的分析采用工具ProtParamtool（http：//web.expasy.org/protparam/）進行。信號肽預測、疏水性分析、跨膜區域預測分別用在線工具SignalP4.1Server、ProtScale和TMHMMServerv.2.0完成。蛋白質二級結構分析借助SOPMA工具實現。利用軟件AlignX（VectorNTISuiteV11.5）對多種植物的FPS蛋白進行多重比對分析，利用ClustalX2.0和MEGA6.0軟件采用鄰接（NJ）方法構建FPS基因系統進化樹，使用Bootstrap對系統樹可信性進行檢驗，重復1000次。應用STRING交互式數據庫（https：//string-db.org/）構建候選蛋白與相關蛋白的相互作用網絡，分析預測IcFPS1蛋白在互作網絡中的作用關系，保留可信度大于0.700相互作用關系，用Cytoscape3.61調整展示互作網絡圖。

1.2.4實時熒光定量PCR分析使用RNA提取試劑盒（PlantRNAExtractionKit）從五種不同的組織器官樣品中提取總RNA。根據IcFPS1基因的cDNA序列設計實時熒光定量引物，上游引物為IcFPSRT-S：5′-ACAGATTACCGAAGGTTGGTATG-3′，下游引物為IcFPSRT-A：5′-GGTTGTCTGGAATTCTACCTCATTA-3′。qRT-PCR內參基因選用的是IcGAPDH，上游引物序列IcGAPDH-S：5′-TATCAACGGCTTCGGTCGCA-3′，下游引物序列IcGAPDH-A：5′-GGACGGAGTCGTACTTGAGCAT-3′。引物送往上海生工生物技術有限公司合成。實時熒光定量PCR在杭州博日科技有限公司的Linegene9600PCR儀上進行，反轉錄和熒光定量PCR的操作依照試劑盒PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser和SYBRRPremixExTaqTMII的操作步驟說明書逐步進行。反應程序為95℃、30s，95℃、5s;60℃、30s，共40個循環。每種樣品三次取樣重復，三次技術重復，并分別設置一個陰性對照（模板為ddH2O）。IcFPS1基因的相對表達水平計算通過使用2-ΔΔCt法完成（Livak&Schmittgen，2001）。

2結果與分析

2.1IcFPS1基因cDNA克隆與序列分析

利用特異性引物，以反轉錄cDNA為模板，通過PCR技術從枸骨中克隆得到一條FPS基因序列，通過NCBI網站的在線程序Blast比對分析顯示該cDNA序列與其他物種的FPS基因序列具有較高的相一致性，克隆獲得的cDNA序列為枸骨的FPS基因，命名為IcFPS1。此cDNA序列長度為1591bp，包含1029bp的開放閱讀框，編碼342個氨基酸（圖1）。

2.2枸骨IcFPS1蛋白質理化性質和結構分析

IcFPS1蛋白質含有342個氨基酸。在線網站分析表明，IcFPS1蛋白質的分子量和等電點分別為39.58kDa和5.18。蛋白質不穩定系數為33.87，該蛋白質為穩定蛋白。SignalP4.1Server信號肽預測結果發現IcFPS1蛋白不含有信號肽，蛋白質疏水性分析顯示IcFPS1為親水蛋白。蛋白質跨膜區域分析結果表明，IcFPS1蛋白不含有跨膜區域。通過SOPMA工具分析該蛋白質二級結構，分析結果表明IcFPS1蛋白主要由α螺旋、無規則卷曲、延伸鏈和β轉角結構組成，其所占比例分別為65.5%、24.56%、6.73%和3.22%。同源比對分析通過在線工具BlASTP（NCBI）和AlignX（VetctorNTI11.5）完成。用NCBI的ConservedDomainSearch工具分析蛋白質保守域，結果顯示IcFPS1蛋白質屬于Isoprenoid_Biosyn_C1超級家族的成員，含有Polyprenylsynthetase保守區域（圖2下劃線區域），表明IcFPS1參與類異戊二烯的生物合成。

2.3枸骨IcFPS1蛋白質的同源比對

同源比對發現，該蛋白質與其他植物的FPS蛋白質相似性較高（圖2）。其中枸骨IcFPS1蛋白質和西洋參（ADJ68004）、人參（AAY87903）、常春藤（APV45530）、龍牙楤木（ADK12004）、積雪草（AAV58896）、白樺（AKQ62666）、野茶樹（ANA11766）、刺五加（AEY77151）和纈草（AIU63880）的FPS蛋白質之間的相似性比分別為89%、88%、87%、87%、87%、87%、87%、87%和86%。不同物種之間FPS蛋白有較高的一致性，暗示在功能上可能也是相同或相似的。

2.4IcFPS1蛋白質的系統分析

系統進化樹采用ClustaIX2.0和MEGA6.0軟件構建的，目的是進一步探索FPS蛋白質在不同物種之間的進化關系。如圖3所示，所有的FPS蛋白都來自于一個共同的祖先，不同物種的FPS蛋白質也被清晰地歸類到三個分支，分別為植物、動物和真菌（圖3）。系統進化樹分析顯示枸骨FPS1蛋白與被子植物界雙子葉植物五加科的FPS蛋白親緣關系最近，聚類在同一分支上;而薔薇科的玫瑰、梅、白梨的FPS蛋白聚類到另一分支上。該結果表明，FPS1蛋白可能與五加科的FPS蛋白質在功能上更為接近。枸骨IcFPS1在功能上也可能與五加科植物的FPS蛋白相同，參與調控三萜皂苷的合成代謝。

2.5枸骨IcFPS1蛋白質互作網絡分析

利用STRING蛋白互作數據庫對枸骨IcFPS1蛋白進行相互作用分析，物種參數選擇模式植物擬南芥，構建了的蛋白互作網絡（圖4）。IcFPS1蛋白可以與10個蛋白互作，其中IPP1、IPP2、GGPS3、GGPS6和ERA1都是植物類異戊二烯合成途徑的調節酶，該互作網絡表明枸骨IcFPS1蛋白可能與這些蛋白存在一些相似的功能，或共同參與植物類異戊二烯的合成代謝過程。

2.6IcFPS1的組織表達分析

為了研究IcFPS1基因的各個組織器官的表達水平，提取枸骨的根、莖、葉、雄花、雌花的總RNA，使用反轉錄試劑盒獲得cDNA，利用qRT-PCR技術測定枸骨各組織器官中IcFPS1基因的表達水平。qRT-PCR分析結果發現，IcFPS1基因在各個組織器官中都有表達。其中在枸骨根中的基因表達量最高，葉中表達量次之，雄花中較低，在莖和雌花中的表達量最低（圖5）。枸骨的主要藥用部位是根和葉片，本研究中IcFPS基因也在這兩個部位中表達量較高。因此，推測IcFPS基因可能參與了枸骨三萜類物質的生物合成調控，是枸骨三萜皂苷合成代謝中的一個關鍵酶基因。

3討論與結論

FPS參與類異戊二烯生物合成途徑，屬于植物次生代謝三萜皂苷與甾醇合成途徑中的一個限速酶，也是三萜皂苷合成生物學研究的其中一個重要酶。本研究克隆得到枸骨的IcFPS1基因，對其進行了生物信息學分析和功能預測。結果表明，IcFPS1蛋白質屬于Isoprenoid_Biosyn_C1超級家族，與其他植物尤其是藥用植物的FPS蛋白質具有較高的相似性，與五加科的FPS蛋白親緣關系較近，結合蛋白質互作網絡分析，證實枸骨IcFPS1參與類異戊二烯代謝途徑，可能參與調控枸骨三萜皂苷的生物合成。

qRT-PCR分析結果表明IcFPS1基因在枸骨各個器官組織中的表達量具有部位差異性，其中在根中的基因表達量最高，其次是葉，在莖和雌花中表達量最少，這種現象或許與FPS在三萜皂苷代謝途徑中的功能有關。目前已在許多植物上進行了FPS基因的分離和功能驗證。Cunilleraetal.（1996）克隆了擬南芥FPS基因，qRT-PCR分析結果表明擬南芥FPS1和FPS2基因在幼苗的根、莖、葉和花中都有表達;其中，FPS1基因在根和花中最高表達，FPS2基因表達水平較低，具有組織表達差異性，這與我們的研究結果相似。在白木香FPS基因功能研究中，組織表達結果表明FPS基因的表達量最高是根，其次是莖，表達量最少的是葉，推測該基因在根和莖兩個組織中發揮生物學功能，與白木香的形成部位相關（楊欣等，2013）;在人參中，FPS基因表達分析結果表明該基因在葉的表達量最多（楊林林等，2017），這與本文研究中根的表達量最多不同。在三七FPS基因的功能研究時發現，在三七細胞中過表達FPS基因可以促進三七總皂苷積累（楊延等，2015）。周秘等（2013）對刺五加法尼基焦硫酸合酶研究發現，PFS基因刺五加整個發育時期的表達量與其皂苷含量呈現基本相似的變化趨勢，證實FPS是刺五加三萜皂苷生物合成的一個關鍵酶。這些結果表明FPS基因的表達與三萜化合物的生物合成密切相關。因此可以推斷，枸骨的IcFPS1基因也可能參與了枸骨三萜類物質的生物合成。

總之，本研究克隆獲得了枸骨的IcFPS1基因，對其核酸序列和蛋白質進行了生物信息學分析預測，構建了枸骨IcFPS1蛋白質互作網絡;并分析了IcFPS1基因在枸骨不同組織部位中的表達水平，該研究為進一步弄清IcFPS1基因在枸骨三萜皂苷生物合成中的作用奠定了基礎，為提高枸骨三萜皂苷含量提供了一定的理論依據。

參考文獻：

CHENL，LANXW，LIK，etal.，2006.GeneticcloningandsequenceanalysisoffarnesylpyrophosphatesynthaseinPanaxnotoginseng[J].ChinTradHerbDrugs，37（7）：1080-1083.[陳莉，藍秀萬，李珅，等，2006.三七法呢基焦磷酸合酶的基因克隆及序列分析[J].中草藥，37（7）：1080-1083.]

CUNILLERAN，ARRM，DELOURMED，etal.，1996.Arabidopsisthalianacontainstwodifferentiallyexpressedfarnesyl-diphosphatesynthasegenes[J].JBiolChem，271（13）：7774-7780.

JIANGD，TANGYL，TAOCC，etal.，2014.CloningandsequenceanalysisoffarnesylpyrophosphatesynthasefromGynostemmapentaphyllum[J].LettBiotechnol，25（2）：198-202.[蔣東，唐銀琳，陶晨陳，等，2014.絞股藍法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及其序列分析[J].生物技術通訊，25（2）：198-202.]

LIGW，WUT，XIEY，etal.，2015.LeavesofIlexcornuta：Researchadvances[J].JIntPharmRes，38（5）：356-361.[李國文，吳弢，謝燕，等，2015.中藥枸骨葉研究進展[J].國際藥學研究雜志，38（5）：356-361.]

LIVAKKJ，SCHMITTGENTD，2001.Analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativePCRandthe2-ΔΔCTmethod[J].Methods，25（4）：402-408.

PENGGQ，YANGDM，2011.MedicinaleffectandhealthprotectionofIlexcornuta[J].ActaAgricJiangxi，23（6）：79-82.[彭國全，楊冬梅，2011.枸骨的藥用功效與保健作用[J].江西農業學報，23（6）：79-82.]

YANGLL，YANGLM，MAXJ，etal.，2017.CorrelationbetweenPanaxginsengfarnesyldiphosphatesynthasegeneexpressionandginsenosidecontent[J].JJilinAgricUniv，39（6）：695-708.[楊林林，楊利民，馬秀杰，等，2017.人參法尼基焦磷酸合成酶基因的表達及其與皂苷含量的關系[J].吉林農業大學學報，39（6）：695-708.]

YANGX，WEIJH，LIUJ，etal.，2013.CloningandexpressionanalysisoffarnesylpyrophosphatesynthasefromAquilariasinensis[J].ChinJChinMatMed，38（19）：3251-3255.[楊欣，魏建和，劉娟，等，2013.白木香法呢基焦磷合酶基因AsFPS1的克隆及表達分析[J].中國中藥雜志，38（19）：3251-3255.]

YANGXM，2013.StudyonrapidpropagationofMatricariachamomillaL.andgenetictransformationofFPSgeneinTobacco[D].Hefei：AnhuiAgricUniv：26-31.[楊秀梅，2013.洋甘菊快速繁殖及FPS基因在煙草中的轉化研究[D].合肥：安徽農業大學：26-31.]

YANGY，LIUDQ，GEF，etal.，2015.Effectofover-expre-ssingfarnesylpyrophosphatesynthase（FPS）geneofPanaxnotoginsengcellonsaponinsynthesis[J].ModFoodSciTechnol，31（8）：59-64.[楊延，劉迪秋，葛鋒，等，2015.三七細胞中過表達FPS基因對皂苷合成的影響[J].現代食品科技，31（8）：59-64.]

ZHANGZB，HOUL，CUIQH，etal.，2015.Bioinformaticsanalysisoftriterpenoidsaponinsbiosynthesispathwayinherbalmedicines[J].ChinTradPatentMed，37（6）：1255-1261.[張召寶，侯林，崔清華，等，2015.中藥三萜皂苷合成通路的生物信息學分析[J].中成藥，37（6）：1255-1261.]

ZHOUM，CHAILH，XIULS，etal.，2013.ExpressionlevelofEleutherococcussenticosusfarnesyldiphosphatedynthasegeneanditscorrelationwithsaponincontent[J].JHenanAgricSci，42（12）：106-109.[周秘，柴麗花，修樂山，等，2013.刺五加法尼基焦磷酸合酶基因的表達及其與皂苷含量的相關性分析[J].河南農業科學，42（12）：106-109.]

ZUOWJ，MEIML，ZENGYB，etal.，2011.ResearchadvancesofthechemicalconstituentsandpharmacologicalactivitiesofIlexcornutaLindl.etPaxt[J].JAnhuiAgricSci，39（27）：16560-16562.[左文健，梅文莉，曾艷波，等，2011.枸骨的化學成分和藥理活性研究進展[J].安徽農業科學，39（27）：16560-16562.]