牛乳鐵蛋白肽衍生肽結構設計及其在畢赤酵母中表達后的活性分析

張恩鵬,呂自力,戴 甜,郭愛珍,王 亮,*

(1.江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮江 212013;2.成都中醫藥大學第二附屬醫院,四川成都 610041)

牛乳鐵蛋白肽(Bovine Lactoferricin,LFcinB)是牛乳鐵蛋白在酸性環境下,經胃蛋白酶水解得到的長25個氨基酸殘基的小分子生物活性肽,具有多種生物活性,在已發現的人、山羊、牛、駱駝、鼠等哺乳類動物乳鐵蛋白肽中,LFcinB抗菌活性最高,對四種腸出血性大腸桿菌的抑制活性比牛乳鐵蛋白高300～350倍[1]。LFcinB具有良好的耐熱性、非抗原性、免疫調節活性、廣譜抗菌和抗病毒活性[2-4],可廣泛作為食品防腐劑[5]、抗氧化劑、營養添加劑等[6]。LFcinB分子量3126.4 Da,相對疏水性48%,電荷數+8。抑菌過程中,LFcinB兩親性結構與膜脂多糖相結合,疏水殘基與膜的親脂部分相互作用[7],使細胞膜形成穿孔,細胞內容物外泄起到抑菌殺菌作用[8],且不產生耐藥性。目前抗生素耐藥性的威脅已經亟需控制,新的抗菌性藥物尋找已迫在眉睫[9],LfcinB無耐藥性特點表明LfcinB是極具潛力的抗菌藥物。由于天然來源有限,酶解分離困難,化學合成成本高昂,因此利用基因工程技術生產LfcinB已經成為研究和發展趨勢[10]。

近年來,研究人員致力于抗菌肽結構與功能關系的研究,以期通過對抗菌肽結構的改變(兩親性參數,凈電荷數,疏水性參數)獲得具有更高抗菌活性的衍生肽[11]。Edwards等[12]通過對六種β-發卡型抗菌肽的研究,發現隨著兩親性的增加其抗菌活性也逐漸增加。Str?m等[13]對LFcinB的15個殘基進行了丙氨酸掃描,發現Trp6和Trp8氨基酸是保持其活性的關鍵。Lejon等[14]對LFcinB的15個殘基進行了色氨酸化學合成替代研究,發現Cys3、Arg4、Met10和Gln14被色氨酸替代后,顯示出比原肽更強的抗菌活性,Cys3、Arg4、Met10和Gln14為設計衍生肽的潛在替換位點。

本研究中,根據抗菌肽數據庫和生物信息學分析,首先對不同物種來源的乳鐵蛋白肽序列進行同源性分析,確定LFcinB的非保守氨基酸位點。其次針對非保守氨基酸位點進行了替代性分析,優化設計出LfcinB-W4。合成LFcinB-W4序列基因后根據多克隆位點構建至外泌型表達載體pPIC9K中,構建的重組表達載體為pPIC9K-LFcinB,電轉化至畢赤酵母GS115后,使用甲醇作為誘導劑誘導LFcinB-W4表達,以期獲得具有高抗菌活性的衍生肽。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATTC25923)、腸沙門氏菌(SalmonellaentericaCGMCC1.755)、大腸桿菌(EschenchiacoliDH5α)、巴斯德畢赤酵母(PichiapastorisGS115)、表達質粒pPIC9K 本實驗室保藏;限制性核酸內切酶SacI、EcoRI、NotI、AvrⅡ、NdeI和T4DNA連接酶 Thermo Fisher Scientific公司;PCRMix及質粒提取試劑盒、膠純化試劑盒、基因組提取試劑盒 Qiagen公司;培養基LB、YPD、PCR引物、LFcinB-W4,10基因序列 上海生工生物工程有限公司;MD瓊脂培養基:葡萄糖20 g/L,YNB 13.4 g/L,瓊脂粉15 g/L;BMGY培養基:蛋白胨20 g/L,酵母粉10 g/L,YNB 13.4 g/L,甘油10 mL/L;BMGY培養基:蛋白胨20 g/L,酵母粉10 g/L,YNB 13.4 g/L,甲醇25 ml/L。

SW-CJ型系列超凈工作臺 蘇州安泰空氣級數郵箱公司;QYC200型恒溫搖床 上海福馬實驗設備有限公司;BPMJ-250F型系列霉菌培養箱 上海一恒科學儀器又按公司;Eppendorf5418R型高速離心機 德國艾本德股份公司;1645050型DNA水平電泳儀、Gene-PluserXcellTM型電轉儀 Bio-Rad生命醫學產品有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因設計與合成 從NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)[15]獲取了7個不同哺乳動物的乳鐵蛋白肽序列,利用生物學軟件ClustalW對其序列進行了同源性對比分析,由此確定LFcinB的非保守氨基酸位點[16]。實驗對LFcinB第4位Arg(非保守氨基酸位點)替換成Trp替換。抗菌肽數據庫APD(http://aps.unmc.edu/AP/)[17]和ExPASy(http://web.expasy.org/protparam)[18]預測了替代后的牛乳鐵蛋白肽衍生肽的理化參數,包括凈電荷、疏水殘基比例、分子量、等電點、脂肪族指數和親水指數。實驗設計中使用同源建模工具SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)[19]對衍生肽的空間結構進行了模擬;同時采用抗菌肽數據庫APD和CAMP(http://www.camp.bicni rrh.res.in/index.php#)[20]預測軟件對其抗菌活性進行了預測。實驗依據畢赤酵母密碼子表達的好嗜性對衍生肽的基因序列進行了優化(圖1),并在基因序列兩端添加EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點,優化后的衍生肽基因序列交由上海生物工程公司合成并構建至pUC載體。

圖1 LFcinB-W4基因序列Fig.1 LFcinB-4 gene sequence

1.2.2 重組表達載體的構建EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切攜帶目的基因的質粒pUC-SP-LFcinB-W4,經瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收,將回收基因片段與同樣經EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切的pPIC9K質粒通過T4 DNA連接酶連接構建表達載體質粒pPIC9K-LFcinB-W4(圖2),pPIC9K-LFcinB-W4熱激法轉化感受態大腸桿菌DH5α進行擴增。用質粒抽提試劑盒提取重組質粒,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。并進一步對其進行AvrⅡ和NdeI雙酶切鑒定及測序鑒定。

圖2 重組表達載體pPIC9K-LFcinB-W4構建Fig.2 Construction of recombinant vector pPIC9K-LFcinB-W4

1.2.3 重組表達載體電轉畢赤酵母GS115及PCR鑒定 感受態畢赤酵母GS115制備[21]。取300 μL種子液接種于含有150 mL新鮮YPD培養基的500 mL搖瓶中,30 ℃ 250 r/min養過夜至A600達1.3～1.5;取1 mL細胞培養物于4 ℃,1500×g離心10 min,棄上清,用1 mL預冷的無菌水重懸沉淀;重復上述操作一次,使用1 mL預冷的無菌1 mol/L山梨醇溶液重懸沉淀,收集菌體后加入300 μL預冷的1 mol/L山梨醇溶液重懸菌體沉淀,冰浴待轉化。

重組表達載體pPIC9K-LFcinB-W4經SacI酶切線性化后用DNA純化試劑盒純化,取10 μL線性化的pPIC9K-LFcinB-W4與80 μL感受態畢赤酵母GS115混合均勻,置入電擊杯中,冰浴5 min后以1500 V,200 Ω,5 ms的條件脈沖電擊轉化,加入1 mL預冷的1 mol/L山梨醇溶液,靜置1～2 h后,于MD培養基30 ℃培養2～3 d。

畢赤酵母GS115體內無天然質粒,重組表達載體需線性化后與宿主染色體發生同源重組,將外源基因表達框架整合于染色體中以實現外源基因的表達。當線性化的重組表達載體pPIC9K-LFcinB-W4與畢赤酵母發生同源重組時存在兩種情況:一種是通過單交換整合入酵母染色體,此時AOX1基因仍被保留,得到的轉化子表型為Mut+;另一種是通過重組替換了酵母染色體上的AOX1基因,從而造成AOX1的缺失,得到的轉化子表型為Muts。實驗挑取10個轉化子接種于25 mL YPD培養基中過夜培養,酵母基因組抽提試劑盒提取基因組DNA。基因組DNA PCR擴增,擴增引物5′AOXⅠ:5′-GACTGGTT CCAATTGACAAGC-3′,3′AOXⅠ:5′-GCAAATGGCAC TGACATCC-3′。PCR反應程序為:94 ℃,5 min(預變性);94 ℃,1 min(變性);55 ℃,45 s(退火);72 ℃,1 min(延伸),30個循環反應后再延伸7 min。實驗設置ddH2O作為空白對照,未轉化質粒的酵母基因組為陰性對照。

1.2.4 LFcinB-W4誘導表達 誘導表達時探究最佳甲醇誘導濃度及發酵時間,需控制培養基成分,發酵溫度,發酵轉速恒定。PCR鑒定后的陽性轉化子于5 mL BMGY培養基30 ℃、250 r/min培養18 h,隨后接種1 mL上述種子液于100 mL BMGY培養基30 ℃、250 r/min培養20 h至A600值為2～6。室溫、3000×g離心15 min收集菌體,重懸于100 mL BMMY培養基中并轉移至500 mL搖瓶中于30 ℃、240 r/min進行甲醇誘導培養。甲醇濃度分別設置為:2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%,發酵時間為120 h,每24 h取樣測定抑菌活性,獲取甲醇最佳誘導濃度與發酵時間。

1.2.5 抑菌活性分析 瓊脂擴散法檢測發酵上清液的抑菌活性[22]。將100 μL、菌體濃度為108CFU/mL的活化黃色葡萄球菌和沙門氏菌培養液分別接種于25 mL LB瓊脂培養基中,于40～50 ℃混勻后制備平板,待平板凝固后使用直徑4 mm的無菌打孔器打孔。每孔加入80 μL,10000×g離心10 min制得的發酵上清液,以80 μL氨芐青霉素溶液(50 mg/mL)作為陽性對照,以未轉化的酵母發酵上清液為陰性對照,37 ℃培養16 h,測量抑菌圈大小,分析其抑菌活性。

1.2.6 濃縮發酵上清液抑菌活性與氨芐青霉素的對比分析 100 mL LfcinB-W4的發酵上清液-60 ℃冷凍干燥48 h,加入10 mL ddH2O復溶,10000×g離心10 min取上清。按1.2.5所述的方法,制備金黃色葡萄球菌平板,用直徑4 mm的打孔器打孔。分別加入80 μL 5和10倍濃縮液,以80 μL氨芐青霉素溶液(50 mg/mL)作為陽性對照,37 ℃培養16 h,分析其抑菌活性。

1.2.7 LFcinB-W4與LFcinB及LfcinB-W10,14對比分析 按照1.2.5所述方法制備金黃色葡萄球菌平板,用直徑4 mm的打孔器打孔。每孔加入80 μL實驗室保存的同等發酵條件下制備的LFcinB、LFcin-W10,14及LFcinB-W4發酵上清液,以80 μL氨芐青霉素溶液(50 mg/mL)作為陽性對照,37 ℃培養16 h,分析其抑菌活性。

1.2.8 LFcinB-W4 Tricine-SDS-PAGE檢測 收集抑菌活性強的發酵上清液,經3 kDa超濾管過濾,收集10 mL濾液,-60 ℃冷凍干燥48 h,加入100 μL ddH2O復溶,進行Tricine-SDS-PAGE分析[23],實驗設置未變異GS115同等發酵條件獲取的上清液為空白對照。

1.3 數據處理

實驗使用ClustalW對氨基酸序列進行同源性比較分析,使用SWISS-MODEL利用同源建模的方法模擬衍生肽空間結構,采用數據分析軟件Origin Lab2017對抑菌數據進行處理,分析獲取最佳甲醇誘導濃度和最佳發酵時間。

2 結果與分析

2.1 基因設計與合成

7種哺乳動物來源的乳鐵蛋白肽序列同源性對比分析結果如圖2所示,相同功能及保守位置的氨基酸殘基用彩色標記,無色的為非保守氨基酸位點。結果顯示LFcinB第4、5號位置的Arg為非保守氨基酸。研究發現,牛乳鐵蛋白肽發揮抑菌作用時,色氨酸(Trp)殘基與磷脂頭部的甘油分子相互作用,使細胞膜形成穿孔,導致細胞內容物的外泄[24],Trp是牛乳鐵蛋白肽發揮抑菌功能的關鍵氨基酸[13],因此設計中將第4位Arg替換為Trp以獲得優化設計的衍生肽。

圖3 7個哺乳動物來源的乳鐵蛋白肽序列同源性分析,無色的為非保守氨基酸位點Fig.3 Homogenization analysis of 7 mammalian-derived lactoferrin peptides,colorless non-conservative amino acid sites注:Homo:人;Mus:鼠;Bos:牛;Bubalus:蟾蜍;Capra:羊駝;Ovis:綿羊;Sus:豬。

APD數據庫的Prediction工具和ExPASy的ProtParam預測分析軟件對LFcinB和LFcinB-W4理化參數的對比分析結果表明(表1),相較于原肽,衍生肽的疏水殘基由48%提升至52%;由于Arg的替換,其凈電荷數由+8降低至+7,可能有利于在表達過程中降低宿主蛋白酶對目的蛋白的降解。

表1 LFcinB及LFcinB-W4理化參數分析Table 1 Analysis of physical and chemical parameters of LFcinB and LFcinB-W4

SWISS-MODEL同源建模得到的LfcinB及其衍生肽空間結構如圖4所示。LFcinB-W4和LFcinB的二級折疊結構是一致的,衍生肽依然具備和原肽類似的結構及生物學功能。

圖4 LFcinB及LfcinB-W4空間結構對比Fig.4 Comparison of spatial structure between LFcinB and LfcinB-W4

CAMP的抗菌肽預測工具對衍生肽的抗菌活性指數預測結果如表2所示,LFcinB-W4的兩數據高于原肽,表明設計的衍生肽氨基酸序列在理論上具有優于原肽的抗菌性,為下一步合成衍生肽基因,構建表達載體提供了理論基礎。

表2 LfcinB及LfcinB-W4抗菌活性預測Table 2 Prediction of antibacterial activity of LfcinB and LfcinB-W4

2.2 重組表達載體的構建

EcoRI和NotI雙酶切目的基因擴增質粒pUC-SP-LFcinB-W4,2.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,檢測到的82 bp條帶(圖5)與目的基因一致。EcoRI和NotI雙酶切pPIC9K,T4 DNA連接酶構建表達載體質粒pPIC9K-LFcinB-W4。根據重組表達載體質粒和空表達載體質粒的序列分析,當使用AvrⅡ和NdeI進行雙酶切鑒定時,空載質粒被切成5881和3395 bp的兩條DNA電泳條帶,而重組質粒由于缺失了AvrⅡ酶切位點只能夠被線性化,電泳時表現為一條帶,1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析如圖6所示,測序結果如圖7所示,結果與預期相符,說明重組表達載體構建成功。

圖5 pUC-SP-LfcinB-W4雙酶切電泳Fig.5 pUC-SP-LfcinB-W4 double enzyme digestion注:M:DNA marker(100～3000 bp)； 1:pUC-SP-LfcinB-W4酶切產物。

圖6 pPIC9K-LFcinB-W4雙酶切鑒定Fig.6 pUC-SP-LfcinB-W4 double enzyme digestion注：M:DNA marker(250～10000 bp)； 1:pPIC9K-LfcinB-W4,10；2:pPIC9K。

圖7 pPIC9K-LFcinB-W4測序Fig.7 DNA sequencing of pPIC9K-LFcinB-W4

2.3 重組表達載體電轉畢赤酵母GS115及PCR鑒定

以轉化子的基因組DNA為模板,PCR后經瓊脂糖凝膠電泳分析,結果(圖8)顯示泳道3～9既含有目的基因條帶(562 bp)也含有AOX1基因條帶(約2.2 kb),為陽性克隆,其甲醇利用型為Mut+;泳道10只有目的基因條帶,為陽性克隆,其甲醇利用型為Muts。

圖8 轉化子PCR鑒定Fig.8 Transformants PCR identification注：M:marker；1:空白對照；2:陰性對照；3～10:轉化子基因組PCR。

2.4 LFcinB-W4的誘導表達及抑菌活性檢測

甲醇利用型為Mut+的陽性轉化子不同的甲醇濃度誘導表達結果(圖9a、圖9b)表明甲醇誘導濃度為2.5%、發酵時間為96 h后,離心收集的發酵上清液抑菌效果最佳,可以推測LFcinB-W4在該條件下具有較高的表達量,抑菌活性高于陽性對照氨芐青霉素。甲醇誘導濃度低于2.5%或位于2.5%～3.0%時,雖具有抑菌活性,但相較于2.5%甲醇誘導濃度,發酵上清液抑菌活性有所降低,即可推測LFcinB-W4表達量低于2.5%甲醇誘導效果。當誘導濃度高于3.0%時,發酵上清液沒有抑菌活性,表明LFcinB-W4在發酵過程中沒有進行表達。實驗以2.5%的甲醇濃度對同一轉化子進行誘導表達,抑菌結果顯示(如圖10a、圖10b),隨著發酵時間的增加,其抑菌活性逐漸增加,發酵時間為96 h時抑菌活性高于陽性對照氨芐青霉素,抑菌活性但發酵時間超過96 h后,抑菌活性逐漸下降,分析是宿主本身的蛋白酶積累增加了LFcinB-W4的降解[25]。金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)和腸沙門氏桿菌(革蘭氏陰性菌)的抑菌結果(圖11)可以看出,LFcinB-W4對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有較強的抑菌活性。

圖9 甲醇濃度誘導對發酵上清液表達活性的影響Fig.9 Effects of induction of different methanol concentration on the expression activity offermentation supernatant 注:1～5:2.0%～4.0%甲醇濃度;6:陰性對照;A:陽性對照。

圖10 發酵時間對發酵上清液抑菌活性的影響Fig.10 Effects of different fermentation time on antibacterial activity of fermentation supernatant注:1～5:24～120 h;6:陰性對照;A陽性對照。

圖11 發酵上清液對典型革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的抑制作用Fig.11 Inhibition of typical Gram-negative bacteria and Gram-positive bacteria by fermentation supernatant 注:a:沙門氏菌;b:金黃色葡萄球菌;1～4:20～80 μL發酵上清液;5:陰性對照;A:陽性對照。

2.5 濃縮發酵上清液與氨芐青霉素抑菌活性對比分析

發酵上清濃縮液抑菌效果(圖12)表明,未濃縮時,同體積發酵上清液抑菌效果同50 mg/mL的氨芐青霉素溶液抑菌效果相當,當上清液通過冷凍干燥的方法濃縮10倍時,其抑菌效果相當于同體積的氨芐青霉素(50 mg/mL)2.5倍左右。

圖12 濃縮發酵上清液抑菌活性與氨芐青霉素對金黃色葡萄球菌抑菌作用的對比分析Fig.12 Comparative analysis of antibacterial activity of concentrated fermentation supernatant and inhibition of ampicillin against Staphylococcus aureus注:1:未濃縮發酵上清液;2:10倍濃縮上清液。

2.6 LFcinB-W4與LFcinB及LfcinB-W10,14對比分析

通過與LFinB及LFcinB-W10,14的對比分析發現(圖13),LfcinB-W4的抗菌活性優于LFinB,與本實驗室設計的LFcinB-W10,14相似,說明關鍵位點氨基酸的替換,可以提高LFinB的抗菌活性。

圖13 LFcinB-W4發酵上清液與LFcinB及LfcinB-W10,14活性對比分析Fig.13 Comparative analysis of antibacterial activity of LFcinB-W4 fermentation supernatant and LFcinB and LfcinB-W10,14注:1:LFcinB-W4發酵上清液;2:LFcinB-W10,14發酵上清液;3:LFcinB發酵上清液;A:陽性對照。

2.7 LFcinB-W4 Tricine-SDS-PAGE檢測

通過Tricine-SDS-PAGE分析發現(圖14),在分子量約3 kDa處出現一條明顯的條帶,而空菌的發酵液未出現條帶,說明衍生肽LFcinB-W4表達成功。

圖14 Tricine-SDS-PAGE鑒定Fig.14 Tricine-SDS-PAGE identification注:M:蛋白Marker;1:LfcinB-W4;2:空白對照。

3 結論

實驗在7種哺乳動物來源的乳鐵蛋白肽序列同源性對比分析的基礎上,對牛乳鐵蛋白肽第4位Arg(非保守氨基酸位點)進行了Trp替換,并依據畢赤酵母密碼子表達的好嗜性對衍生肽的基因序列進行了優化,實驗旨在探究氨基酸殘基的改變對衍生肽抗菌活性的影響。乳鐵蛋白肽第4位Arg(非保守氨基酸位點)進行了Trp替代后抑菌活性增加,在一定程度上增加了衍生肽的疏水性,有利于衍生肽與細胞膜脂的相互作用,同時正電荷一定程度上的降低減少了畢赤酵母自身分泌的蛋白酶對衍生肽的降解。這些結果證明適當改變衍生肽的理化性質、空間結構,可在一定程度上影響抗菌肽的抗菌活性。也為進一步優化設計衍生肽增強其抗菌活性提供了一定的理論指導基礎。

實驗在LFcinB-W4基因兩側添加了EcoRI和NotI的限制性酶切位點,構建重組表達載體質粒pPIC9K-LFcinB-W4,經SacI線性化后電轉至畢赤酵母宿主菌GS115中,PCR鑒定后,共獲得10株整合成功的陽性轉化子,其中9株為甲醇利用快型(Mut+),實驗結果其中1株LFcinB-W4表達及抗菌效果最佳,其發酵優化條件為甲醇誘導濃度為2.5%,發酵時間為96 h。同時抑菌實驗也表明設計得到的牛乳鐵蛋白肽衍生肽對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均具有較強的抑制作用,但對革蘭氏陽性菌的抑菌作用優于革蘭氏陰性菌。

畢赤酵母異源蛋白表達系統容易出現宿主蛋白酶降解表達產物的現象。研究發現當發酵時間高于96 h時,發酵上清液抑菌效果有所降低,分析為可能是由于宿主蛋白酶積累增加了LFcinB-W4降解的結果,為了大量獲得LFcinB-W4,需設計相關實驗增加融合蛋白設計,降低表達產物正電荷攜帶量,同時進一步研究優化發酵條件、培養基組成、降低LFcinB-W4降解速率。