乳鐵蛋白對IL- 1β誘導人骨關節炎滑膜成纖維細胞MMPs、COX- 2、PGE2產生的影響

崔冠軍，程 超，單文山，王 俊，萬云鵬，李 磊，尹宗生

骨關節炎(osteoarthritis,OA)是一種進行性關節退變疾病，其主要特征是合成代謝失衡與細胞外基質降解[1]。在OA病理生理過程中，滑膜病變起著重要的作用[2]。滑膜組織主要功能細胞為滑膜成纖維樣細胞(fibroblast- like synoviocytes，FLS)[3]，它能夠被炎癥細胞因子白介素- 1β(interleukin 1 beta，IL- 1β)活化，產生與OA相關的基質金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase- 1，MMP- 1)和基質金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase- 13，MMP- 13)[4]。另外，IL- 1β也能夠通過上調FLS中環加氧酶- 2(cyclooxygenase- 2，COX- 2)的表達來誘導前列腺素E2[prostaglandin E(2)，PGE2]的產生，從而在OA發病機制中起關鍵作用[5]。PGE2能夠增加基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和其他分解代謝物質的產生來影響關節組織的結構和功能[6]。乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)作為一種鐵結合性糖蛋白，具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗氧化、抗炎等作用[7]。因此，本實驗依據乳鐵蛋白抗炎的特性，來研究LF對IL- 1β誘導的人OA滑膜細胞MMP1、MMP13、COX- 2、PGE2產生的影響，為OA治療方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器乳鐵蛋白(上海西寶生物技術公司)；胎牛血清(美國clark公司)、DMEM 高糖培養基(美國Hyclone公司)； 胰酶細胞消化液(上海Beyotime公司)；鏈霉素-青霉素(上海Beyotime公司)；CCK- 8試劑(七海生物技術公司)；TRIzol Reagent(美國ambion公司)；PCR試劑盒(南京Vazyme公司)；MMP- 1、MMP- 13、COX- 2、GAPDH 引物序列(上海生工生物工程有限公司)；MMP1、MMP13、COX- 2抗體(武漢Elabscience公司)；波形蛋白(Vimentin，VM)抗體(上海Beyotime公司)；Goat Anti- Rabbit IgG(H+L)(Alexa Fluor594 conjugated)(武漢Elabscience公司)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)；酶標儀(武漢優爾生科技股份公司)；基因擴增儀(型號：TC- XP，杭州博日科技有限公司)；凝膠成像掃描系統(美國RAD公司)。

1.2 OA滑膜組織來源滑膜取自2017年11月～2018年6月安徽醫科大學第一附屬醫院關節外科OA行膝關節置換的患者。研究對象都填寫了書面知情同意書，本研究經該院倫理委員會審核批準通過。

1.3 方法

1.3.1OA滑膜成纖維細胞分離、培養與鑒定 應用組織塊法培養FLS，手術中無菌條件下取下標本，然后在無菌操作臺下用剪刀去除滑膜組織中脂肪、肌肉以及韌帶組織等。用高壓的(含雙抗)PBS沖洗幾遍組織，盡可能的將血性和脂肪顆粒沖洗干凈。用剪刀剪成1 mm×1 mm×1 mm碎片，而后用無菌巴氏管將滑膜組織均勻的貼在25 cm3的培養瓶中，隨后將培養瓶緩慢豎起，向培養瓶中緩慢加入約3 ml含20%FBS DMEM高糖(含雙抗)培養基，垂直放入含5%CO2、37 ℃培養箱內，大約3～6 h后，將培養基緩慢翻轉放平，使培養基浸沒組織，避免將組織沖掉，最后再置入培養箱中繼續培養。第2天用巴氏管將未貼壁的滑膜組織除去。根據培養瓶培養基的顏色和細胞狀況換液，每隔2～3 d換1次培養液，如果細胞內有較多雜質可用無菌PBS輕輕沖洗1～2遍。等細胞鋪滿培養瓶后進行傳代，用0.25%的胰蛋白酶(不含EDTA)進行消化后傳代。經過3～4次傳代以后，FLS純度達到99%左右[8]。另外，根據成纖維細胞表達VM的特性，應用細胞免疫熒光技術進行定性鑒定。選取第3～4代的細胞用于本實驗研究。

1.3.2CCK8法檢測LF對FLS活性的影響 FLS被接種于96孔板，每孔100 μl(含約8×103個細胞)。細胞分組:調零組、空白對照組、LF處理組(LF質量濃度為10、50、100、200、400 μg/ml)。置于37 ℃、5%CO2培養箱中孵育24 h后，棄各孔培養基，向每孔加入90 μl含上述LF處理濃度的DMEM高糖培養基，而后再加入10 μl的CCK8溶液繼續孵育4 h。用酶標儀測定450 nm處的吸光度，該實驗重復3次。

1.3.3實驗分組及細胞處理 將實驗分為3組，分別是空白對照組、誘導組、誘導加治療組。取3～4代的細胞進行實驗，將消化下來的細胞懸液以每孔2×105個細胞均勻的接種于6孔板中，12～24 h后細胞基本鋪滿板底后，空白對照組不加任何藥物，誘導組加入IL- 1β(10 ng/ml)，誘導加治療組加入IL- 1β(10 ng/ml)和乳鐵蛋白(100、200、400 μg/ml)。將以上各組置于5%CO2、37 ℃培養箱中培養24 h，24 h后收集上述細胞和上清液。

1.3.4OA滑膜成纖維細胞蛋白和RNA的提取和檢測 收集上述處理的細胞，應用RIPA裂解法和TRIzol法提取FLS總蛋白和總RNA。以GAPDH作為內參，采用 Western blot和RT- PCR法檢測細胞中MMP1、MMP13、COX- 2蛋白和mRNA的表達情況。

1.3.5應用ELISA法檢測PGE2的表達情況 取3～4代細胞，以每孔約2×105個細胞均勻的接種到6孔板中，等細胞鋪滿板底80%后。根據上述實驗分組進行處理，處理過后置培養箱中繼續培養24 h，24 h后用PGE2的ELISA試劑盒檢測細胞上清液中PGE2含量。

2 結果

2.1 人FLS的分離與培養經組織塊法培養4～7 d后開始爬出少量長梭型細胞，細胞呈放射狀分布生長，期間混雜較多圓形的滑膜巨噬細胞。14 d后基本爬滿培養瓶，進行傳代，傳到3代后視野中基本見不到滑膜巨噬細胞且滑膜成纖維細胞已表現出成纖維樣細胞的典型形態，從形態上觀察基本都為成纖維樣細胞，細胞形態規則，呈梭形，核呈橢圓形位于細胞中央，細胞狀態良好，見圖1。

圖1 滑膜成纖維細胞

2.2 滑膜成纖維細胞的鑒定根據成纖維細胞特異性表達VM的特性，應用細胞免疫熒光方法染色結果顯示所有細胞胞質均呈紅色，DAPI復染后細胞核呈藍色，證明所培養細胞為成纖維細胞，見圖2。

圖2 滑膜成纖維細胞免疫熒光鑒定結果

A：多聚甲醛固定的普通白光×100；B：DAPI熒光染色×400； C：Vimentin蛋白免疫熒光×400；D：B、C 組合圖×400

2.3 CCK8檢測LF對FLS活性的影響CCK8結果顯示：不同濃度的LF(10、50、100、200、400 μg/ml)對FLS活性與空白對照組比較,各組之間均無明顯差異(F=0.84，P>0.05)，見圖3。表明在一定濃度范圍內LF(0～400 μg/ml)不影響FLS的活性。

圖3 LF對FLS活性的影響

2.4 LF對IL- 1β誘導人OA滑膜成纖維細胞MMP1、MMP13、COX- 2 mRNA的影響RT- PCR結果提示，與空白對照組比較，IL- 1β誘導組FLS中MMP1、MMP13、COX- 2 mRNA的表達有顯著差異(P<0.01)，IL- 1β誘導組與IL- 1β+LF組(200 μg/ml)比較顯示，LF對IL- 1β導致的滑膜成纖維細胞中MMP1、MMP13、COX- 2 mRNA的表達差異有統計學意義(P<0.01)。組間比較差異有統計學意義(FMMP1=21.05，FMMP13=317.1，FCOX- 2=74.59,P<0.01，見圖4。

圖4 MMP1、MMP13、COX- 2 mRNA在FLS中的表達

與空白對照組比較：**P<0.01；與IL- 1β誘導組比較：##P<0.01

2.5 LF對IL- 1β誘導人OA滑膜成纖維細胞MMP1、MMP13、COX- 2蛋白水平表達的影響用WB技術測定結果提示：IL- 1β(10 ng/ml)誘導組與空白對照組比較，IL- 1β組中MMP1、MMP13、COX- 2蛋白的表達差異有統計學意義(P<0.01),而IL- 1β誘導組與IL- 1β+LF(200 μg/ml)組比較，LF對IL- 1β誘導的OA滑膜成纖維細胞中MMP1、MMP13、COX- 2蛋白表達差異有統計學意義(P<0.05)，各組間比較差異有統計學意義(FMMP1=204.6，FMMP13=61.83，FCOX- 2=653.7，P<0.01)，見圖5。

圖5 MMP1、MMP13、COX- 2蛋白在FLS中的表達

2.6 乳鐵蛋白對IL- 1β誘導人OA滑膜成纖維細胞PGE2表達的影響用ELISA試劑盒測量上述處理的細胞上清液結果提示：與空白對照組比較，IL- 1β誘導組細胞產生的PGE2明顯升高，而用IL- 1β+LF(200 μg/ml)組的細胞產生PGE2相對于只用IL- 1β明顯降低(P<0.05)，各組間比較差異有統計學意義(F=90.44，P<0.01)。見圖6。

2.7 不同劑量的LF對IL- 1β誘導人OA滑膜成纖維細胞MMPs、COX- 2、PGE2表達的影響應用Western blot和RT- PCR法分別測量按上述方法處理的細胞中的MMPs、COX- 2蛋白和mRNA表達水平，用ELISA法測量PGE2表達水平。結果提示：與空白對照組比較，IL- 1β誘導組中MMPs、COX- 2、PGE2的表達明顯差異，差異有統計學意義(P<0.05)；與IL- 1β誘導組相比，在一定濃度范圍內，LF對IL- 1β誘導人OA滑膜成纖維細胞MMPs、COX- 2、PGE2的表達呈劑量依賴性，差異有統計學意義(F=3.625,P<0.05)。見圖7。

圖6 PGE2在細胞上清液中表達情況

與空白對照組比較:**P<0.01；IL- 1β誘導組比較：##P<0.01

3 討論

OA是最普遍的關節炎疾病，是導致殘疾的主要原因，其主要特征在于關節軟骨的組成、結構和功能的顯著改變，然而OA病變不只是軟骨的病變，還有關節其他組織病變，如滑膜、脂肪墊、軟骨下骨以及半月板和韌帶等細胞和結構的變化，其中滑膜病變對OA進展起到重要作用[9]。在與滑膜病變相關的多種炎癥介質中，MMP1、MMP13、COX- 2以及PGE2都對滑膜的病變起到重要作用，它們能夠促進OA的病變。MMP- 1屬于 MMPs 中的膠原酶亞家族， 能夠降解軟骨基質中主要組成成分Ⅱ 型膠原，同MMP1一樣，MMP13也屬于膠原酶，它又稱為膠原酶3，它能夠水解Ⅰ、Ⅱ型膠原且作用比MMP1更強[10]。 因此滑膜細胞中MMP1和MMP13大量產生對OA關節結構中細胞外基質的損害增加，加速了軟骨破壞，進而導致OA病變的加速。炎癥細胞因子IL- 1β能夠激活滑膜細胞中MMP- 1和MMP- 13的產生[4]。此外，IL- 1β也能誘導滑膜細胞中環氧化酶的產生來促進一氧化氮、PGE2的分泌，而PGE2的合成受COX- 2的影響。PGE2是一種多效性炎癥介質[11]，它能夠增加MMPs和其他分解代謝物質的產生進而影響關節組織結構和功能。因此它們能夠作為OA治療的靶點。

圖7 LF對IL- 1β誘導的FLS中MMPs、COX- 2、PGE2在基因和蛋白水平表達的影響

A:各組細胞中MMP1、MMP13、COX- 2基因表達的情況；B:各組細胞PGE2表達的情況；C:各組細胞中MMP1、MMP13、COX- 2蛋白表達的典型條帶圖；D:MMP1、MMP13、COX- 2蛋白表達灰度值統計圖；1：空白對照組；2：IL- 1β誘導組；3、4、5：LF(100、200、400 μg/ml)+IL- 1β(10 ng/ml)組；與空白對照組比較:*P<0.05，**P<0.01；與IL- 1β誘導組比較：#P<0.05，##P<0.01

乳鐵蛋白作為一種多效性分子，主要存在于牛奶、唾液、眼淚、支氣管和腸分泌物以及嗜中性粒細胞顆粒中且在炎癥的情況下明顯升高[7]。目前，已經在多種組織和細胞中研究它的抗菌、抗炎和免疫調節活性[7]。Togawa et al[12]研究發現LF能夠抑制結腸炎中IL- 1β的產生。本研究表明LF在人滑膜中的生物學效應能夠抑制IL- 1β誘導滑膜細胞中多種基質降解酶以及炎癥介質的產生。OA滑膜細胞在炎癥細胞因子[如IL- 1β、腫瘤壞死因子- α(tumor necrosis factor- alpha，TNF- α)等]作用下上調MMPs(如MMP- 1、MMP- 13)。MMPs能夠促進關節膠原降解[13]，導致OA軟骨的病變。本研究還表明，LF能夠對人OA滑膜起到有效的抗炎作用。LF對OA滑膜被炎癥細胞因子刺激的抗炎能力揭示了其在預防和治療滑膜炎的潛力。在OA滑膜成纖維細胞中IL- 1β通過上調COX- 2表達來誘導PGE2的產生從而在OA發病機制中起關鍵作用[6]。PGE2能夠增加MMPs和其他分解代謝物質的產生，導致軟骨降解、基質合成的抑制和軟骨細胞凋亡。因此，如果能夠降低OA滑膜細胞中COX- 2和PGE2的產生，那么這可能改善OA的癥狀。 Rasheed et al[14]發現LF能夠抑制OA軟骨細胞中COX- 2和PGE2的產生。在OA滑膜細胞中，本研究表明LF也能夠抑制IL- 1β誘導OA滑膜細胞中促炎介質COX- 2和PGE2的產生而且呈劑量依賴性。綜上所知，LF對IL- 1β誘導人OA滑膜細胞產生的炎癥介質所導致的分解代謝和致炎作用具有明顯的抑制作用。因此，LF可能對OA具有保護作用，它可能成為預防或治療退行性關節疾病的調節分子，但是具體的作用機制仍需要進一步研究。