二苯乙烯苷減輕小鼠急性腦缺血再灌注后的氧化應激損傷及其對自噬的影響

張奇龍，薛 威，徐博涵，唐 虹，江 勤，董六一

腦卒中是一類復雜的高發病，發病后其病死率、致殘率及復發率均高，目前已經成為威脅人類健康的三大疾病之一。其中缺血性卒中約占腦卒中疾病總數的70%，是由于大腦血供障礙而引發的缺血、缺氧，導致局限性腦缺血性壞死的一種疾病[1]。二苯乙烯苷(tetrahydroxystilbene glycoside, TSG)是從中藥何首烏中提取的有效成分，國內外研究[2]表明TSG具有抗氧化、抗補體、擴張血管、抑制Ca2+- ATP酶活性等保護作用，但是TSG對腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI)的作用機制尚不清楚。該實驗擬通過建立小鼠急性腦缺血再灌注模型，研究TSG對小鼠急性CIRI引起的氧化應激及自噬的影響，初步探討TSG對抗CIRI的可能機制，為其應用于臨床提供理論與實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物5周齡SPF級雄性昆明小鼠，體質量22～24 g，購自安徽醫科大學省級實驗動物中心，動物生產合格證號：SCXK(皖)2011- 002，飼養與實驗均在安徽醫科大學實驗動物中心屏障環境中進行，溫度范圍(22±3)℃，濕度范圍：40%～70%，照明周期：12 h明/12 h暗，自由攝水進食。

1.2 藥品與試劑TSG購自南京道斯夫生物科技有限公司；自噬相關基因Beclin1抗體、微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule- associated protein 1 light chain 3, LC3)抗體購自英國Abcam公司；BCA蛋白檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術公司；辣根過氧化物酶標記兔、鼠二抗購自北京中杉金橋生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)測定試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；蘇木精-伊紅染料購自南京凱基生物技術發展有限公司；多聚甲醛溶液購自成都市科隆化學品有限公司；二甲苯購自四川綠森林化工有限公司；水合氯醛購自合肥國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 主要儀器ChemiDoc MP化學發光成像系統購自美國Bio- Rad公司；SpectraMax190酶標儀購自美國Molecular Devices公司；立式夾心電泳槽購自美國Bio- rad公司；DYY 8C型電泳儀購自北京六一儀器廠；PVDF膜購自美國Millipore公司；光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；石蠟切片機購自德國LECIA公司。

1.4 實驗方法

1.4.1實驗分組 小鼠適應性喂養5 d后，隨機分成5組，分別為：假手術組、模型組、TSG低劑量組(3 mg/kg)、TSG中劑量組(6 mg/kg)、TSG高劑量組(12 mg/kg)，每組20只，其中10只小鼠用于腦組織含水量檢測，另外10只小鼠用于腦組織病理學檢測和免疫印跡蛋白檢測。

1.4.2小鼠急性CIRI模型建立 所有小鼠術前禁食不禁水12 h，進行手術造模。參照Wang et al[3]的方法略加改進，10%水合氯醛進行腹腔注射麻醉，備皮，頸部皮膚切開約1.0 cm，鈍性分離皮下組織，暴露出雙側頸總動脈，下穿以6- 0號手術縫合線，結扎2 h而后松開絲線進行再灌24 h 。在缺血2 h和再灌注24 h內用電熱毯維持小鼠肛溫在(36.5～37.5) ℃ 。假手術組僅做雙側頸總動脈分離，不做結扎處理。TSG于缺血和再灌注前尾靜脈注射給藥各1次，給藥容積為0.1 ml/10 g，假手術組和模型組僅給予等量的生理鹽水。

1.4.3腦組織含水量檢測 造模后小鼠快速斷頭取出大腦，去除小腦和腦干，用濾紙吸干表面液體。用電子天平稱取標本的濕重，然后將腦組織置入電熱恒溫烘箱(110±2) ℃中烘24 h至恒重，稱取干重。采用干、濕比重法，計算腦組織含水量。公式如下：腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4.4病理組織學檢查 小鼠腦缺血再灌注后處死取腦，置于4%多聚甲醛中固定，經石蠟包埋制成切片，進行蘇木精-伊紅(HE)染色，正置顯微鏡下觀察小鼠腦組織病理變化。

1.4.5血清SOD活性與MDA含量檢測 各組小鼠造模后摘除眼球采血，室溫靜置30 min后放入提前預冷好的4 ℃離心機，4 000 r/min離心10 min后取上清液，即為血清，迅速放入-80 ℃冰箱保存備用。參照試劑說明書檢測血清SOD活性及MDA含量。

1.4.6蛋白印跡法檢測自噬蛋白表達水平 將腦組織于冰上反復研磨制備腦組織勻漿；加入適量RIPA裂解液, 4 ℃離心后取上清液,BCA試劑盒測總蛋白濃度。以10～50 μg總蛋白上樣, 12%SDS- PAGE凝膠電泳, 電泳結束后轉膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，經牛奶封閉、TBST漂洗后, 分別加入Beclin1及LC3一抗(1 ∶1 000), 在4 ℃冰箱放置過夜后再加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶2 000) ，TBST洗膜， 發光顯影，曝光拍照。采用Image J圖像處理軟件分析采集的圖像, 以Beclin1、LC3- Ⅱ/Ⅰ與β- actin蛋白條帶灰度的比值來表示Beclin1、LC3- Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達水平。

1.5 統計學處理采用 SPSS 17.0進行統計分析，多組間均數比較采用單因素方差分析檢驗，檢驗水準取α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TSG對CIRI小鼠腦含水量的影響與假手術組相比，模型組小鼠腦組織含水量顯著增加(F=2.55，P<0.01)。與模型組比較，TSG高、中劑量組可顯著抑制小鼠腦組織含水量的增加(P<0.05，P<0.05)，有效改善腦組織水腫程度，見表1。

表1 TSG對CIRI小鼠腦含水量的影響

與假手術組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05

2.2 TSG對CIRI小鼠腦組織病理學變化的影響HE染色結果顯示，假手術組小鼠腦皮質神經元細胞和神經膠質正常，排列整齊，神經元細胞形態正常，毛細血管和小血管管腔較窄或呈實性條索，未見腦神經元損傷等病理性改變；模型組小鼠腦皮層神經元細胞呈現不同程度的變性、壞死，中性粒細胞炎性浸潤，間質細胞水腫疏松呈網狀，神經細胞、毛細血管和小血管周圍的間隙增寬，神經膠質細胞腫脹，其胞質透亮區加大。TSG高、中劑量治療組小鼠腦皮層神經元的病理性損傷較輕，神經元細胞數量增加，并可改善神經元細胞形態，減輕核固縮，見圖1。

圖1 TSG對小鼠腦CIRI后皮層腦組織病理學損傷的影響HE×200 A：假手術組；B：模型組；C：TSG高劑量組；D：TSG中劑量組；E：TSG低劑量組

2.3 TSG對CIRI小鼠血清中SOD、MDA含量的影響與假手術組相比，模型組動物血清中SOD活性明顯降低(F=3.71，P<0.05)，與模型組比較，TSG高、中劑量組可顯著升高小鼠血清中SOD活性(P<0.01，P<0.05)；與假手術組比較，模型組動物血清中MDA含量明顯增高(F=5.14，P<0.01)，與模型組比較，TSG高、中劑量組可顯著降低小鼠血清中MDA的含量(P<0.05，P<0.05)，見表2。

表2 TSG對CIRI小鼠血清中SOD、MDA含量的影響

與假手術組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.4 TSG對小鼠CIRI誘導的自噬蛋白Beclin1表達的影響蛋白印跡法檢測結果顯示，模型組Beclin- 1蛋白相對表達顯著升高，與假手術組相比，差異有統計學意義(F=4.83，P<0.05)。TSG高劑量組可顯著抑制缺血再灌注誘導的Beclin- 1上調(P<0.05)，見圖2。

圖2 TSG對CIRI后Beclin1蛋白表達的影響

1：假手術組； 2：模型組； 3： TSG高劑量組；4：TSG中劑量組；5：TSG低劑量組;與假手術組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.5 TSG對小鼠CIRI誘導的自噬蛋白LC3- Ⅱ/Ⅰ表達的影響蛋白印跡法檢測結果顯示，小鼠缺血再灌注24 h后，模型組中LC3- Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達水平明顯高于假手術組(F=12.17，P<0.05)。與模型組比較，TSG高劑量組可明顯抑制LC3- Ⅱ/Ⅰ的相對表達(P<0.05)，見圖3。

圖3 TSG對CIRI后LC3- Ⅱ/Ⅰ蛋白表達的影響

1：假手術組； 2：模型組；3：TSG高劑量組；4：TSG中劑量組；5：TSG低劑量組;與假手術組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

3 討論

TSG是傳統中藥何首烏的主要有效成分之一，具有抗機體氧化、提高免疫力、抗動脈粥樣硬化、抗炎抗腫瘤等作用，有“益血氣、益精髓、黑鬢發、延年不老”的功效[4]。既往研究[5]顯示，何首烏及其活性成分可以減輕腦缺血引起的神經細胞損傷，促進腦缺血后神經功能的恢復，但對缺血性腦損傷的藥理活性及機制尚未有效闡明。

細胞內活性氧代謝的平衡被破壞而有利于活性氧的積累，活性氧積累的危害之一是引發或加劇脂質過氧化作用，造成細胞膜系統的損傷[6]。SOD、還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)等都是防御系統中的重要抗氧化劑。在腦缺血再灌注時過氧化物大量產生，抗氧化系統的過度消耗又不能得到及時的補充，導致體內SOD、GSH活性降低，同時因脂質過氧化使MDA的生成量升高，造成嚴重的遲發性神經功能損害。本研究結果顯示，小鼠急性CIRI后血清中SOD活性明顯降低，MDA含量明顯增加， TSG高、中劑量組(12、6 mg/kg)均能顯著升高小鼠血清中SOD活性，降低MDA的含量，提示TSG能夠抑制脂質過氧化反應，對減輕繼發性腦損傷具有重要作用，與其他學者的發現一致[7]。

CIRI的病理生理機制極其復雜，包括細胞內鈣超載、氧自由基異常增多、興奮性氨基酸類神經遞質的毒性作用、微循環障礙和多種炎性細胞因子釋放等[8-9]。當缺血再灌注損傷發生后，可以出現壞死性細胞死亡和凋亡性細胞死亡，但近年來自噬逐漸被認為是除細胞壞死和凋亡外的第 3 種死亡方式[10]。越來越多的實驗證據表明[11]，氧化應激能誘導自噬的發生并且應用抗氧化劑能抑制自噬并減少細胞死亡。神經元損傷的嚴重程度直接關系到自噬在腦缺血性損傷中的作用。在輕度饑餓、缺氧等情況下，自噬不僅通過降解蛋白提供能量，而且能夠通過降解損傷的蛋白后合成新的蛋白，從而保護著機體的細胞。若重度缺血、缺氧或延長細胞損傷的時間激活相關調控蛋白后，自噬也過度激活，過度激活的自噬又進一步促進細胞損傷的發生，從而對機體產生損傷作用[12-13]。腦缺血時腦組織血流不足，腦細胞代謝障礙，最終導致腦細胞嚴重不可逆性損傷和死亡。本研究顯示CIRI后腦皮層神經元細胞呈現不同程度的變性壞死且排列紊亂無層次感，模型組的自噬相關蛋白Beclin1、LC3- Ⅱ/Ⅰ表達水平較假手術組明顯增加，提示缺血再灌注損傷后神經元損傷明顯增加，自噬水平明顯提高，而用TSG干預后腦皮層的病理損傷得以減輕，且與模型組相比自噬相關蛋白Beclin1、LC3- Ⅱ/Ⅰ表達顯著降低，提示TSG能夠抑制缺血后的過度自噬，保護缺血神經元損傷，但TSG對通過何種途徑抑制自噬相關基因的表達還有待進一步研究。