分散固相萃取法結(jié)合UPLC-MS/MS同時(shí)分析茶葉中13種殺菌劑

黃 彪，劉文靜，吳建鴻

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所/福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350003）

1 前言

在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，殺菌劑主要是指用于防治由各種病原微生物引起的植物病害的一類(lèi)農(nóng)藥。殺菌劑能很好的防治植物病害，起到保護(hù)植物、促進(jìn)生產(chǎn)的作用，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物的種植過(guò)程。由于農(nóng)藥殘留的潛在危害，許多國(guó)家及國(guó)際組織都對(duì)農(nóng)藥殘留嚴(yán)格規(guī)定了殘留限量[1-2]。我國(guó)茶葉品種資源多，種植區(qū)域廣，茶樹(shù)在種植過(guò)程中從葉、莖、根到花等均可能有病蟲(chóng)危害，因此殺菌劑在茶葉的種植過(guò)程中應(yīng)用較多，國(guó)際貿(mào)易中對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留最高限量的規(guī)定越來(lái)越嚴(yán)格，有關(guān)茶葉的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)也更為嚴(yán)苛，而我國(guó)一直以來(lái)是重要的茶葉出口大國(guó)，因此研究茶葉中殺菌劑殘留的檢測(cè)方法具有非常重要的意義。

快速、高效的農(nóng)藥殘留分析方法能否建立在很大程度上取決于樣品前處理過(guò)程，高效的前處理技術(shù)往往能大大減少分析的成本和時(shí)間。目前，農(nóng)產(chǎn)品中殺菌劑的檢測(cè)常見(jiàn)前處理方法有液液萃取、固相柱萃取、分子印跡固相萃取及分散固相萃取等[3-7]。分散固相萃取技術(shù)相比于其他前處理方法具有溶劑用量少，提取速度快，重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，在樣品前處理過(guò)程中得到廣泛應(yīng)用。殺菌劑的檢測(cè)方法主要有毛細(xì)管電泳法[8]、氣相色譜法[9-10]、液相色譜法[11-12]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-14]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-17]等。

質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)因其抗干擾強(qiáng)，檢測(cè)快速，靈敏度高，定性定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸發(fā)展成為分析檢測(cè)中的主導(dǎo)技術(shù)，而尤其是超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)，將超高效液相色譜儀對(duì)復(fù)雜樣品的快速分離能力與質(zhì)譜儀對(duì)目標(biāo)離子的高選擇性、高靈敏度相結(jié)合，在食品安全、藥物分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域中越來(lái)越發(fā)揮出重要作用。在已有報(bào)道中，利用分散固相萃取結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)茶葉中殺菌劑殘留的報(bào)道尚不多見(jiàn)。本研究利用分散固相萃取法前處理凈化，建立了超液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析茶葉中殺菌劑殘留。該方法樣品前處理時(shí)間短，分析快速，準(zhǔn)確性好，可為茶葉殺菌劑殘留定性定量分析提供方法參考依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；Xevo TQ-S三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；樣品均質(zhì)器（德國(guó)IKA公司）；SYG-2水浴恒溫振蕩器（常州朗越儀器有限公司）；XW-80A旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；Millipore Qirect-Q5超純水設(shè)備（美國(guó)Millipore公司）。

乙腈（色譜純，美國(guó)Waters公司）、甲醇（色譜純，美國(guó)Waters公司）、乙酸銨（LC-MS級(jí)，美國(guó) Waters公司）、甲酸（LC-MS級(jí)，美國(guó)Waters公司）、N-丙基乙二胺（PSA，40 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司）、C18吸附劑（40-60 μm，天津博納艾杰爾有限公司）、超純水（Millipore超純水機(jī)制備），其他試劑為分析純。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

氟硅唑、丙環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品（純度97%，德國(guó)DR公司），用乙腈溶解配制成濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；三唑酮、苯醚甲環(huán)唑、多效唑等農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，濃度規(guī)格為1 000 mg/L。標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液置于-20℃冰箱中保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)取儲(chǔ)備液配制成10 mg/L的單標(biāo)中間液，用空白基質(zhì)溶液配制的用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的不同濃度的混標(biāo)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3 樣品前處理方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取5.00 g（精確至0.01 g）磨碎的茶葉樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，用均質(zhì)器以15000 r/min均質(zhì)提取1 min后，蓋好蓋子振蕩提取15min，以 8 000 r/min離心5 min；轉(zhuǎn)移上清液2.0 mL到預(yù)先加有50 mg PSA，50 mg C18，10 mg石墨化炭黑GCB的10 mL離心管中，渦旋30 s后，8 000 r/min離心1min；取上清液過(guò)0.22 μm 濾膜，濾液供UPLC-MS/MS分析。

2.4 色譜-質(zhì)譜條件

超高效液相色譜條件：Waters T3 C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm，）；柱溫：30.0℃；梯度洗脫：流動(dòng)相A為0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨水溶液，流動(dòng)相 B 為乙腈；0～3 min，90%～70%A ；3～5 min，維持 70%A；5～8 min，70%～20%A；8～10 min，20%～90%A；流動(dòng)相流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：4 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧ESI+掃描方式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；錐孔氣流：氮?dú)猓魉?0 L/h；脫溶劑溫度：150℃，流速 800 L/h；離子源溫度：150 ℃；霧化氣壓力：0.28 MPa；碰撞氣：高純氬氣。相關(guān)質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表1。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，比較了以甲醇-水和乙腈-水作為流動(dòng)相以及在流動(dòng)相中添加甲酸、乙酸銨對(duì)目標(biāo)化合物的分離效果及目標(biāo)離子色譜峰峰型的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：采用乙腈-5 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）作為流動(dòng)相時(shí)，在正離子掃描模式下，殺菌劑有良好的峰形且相對(duì)于不加甲酸的流動(dòng)相有更好的響應(yīng)強(qiáng)度，甲酸的加入有利于目標(biāo)分子更好的形成正離子，5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液緩沖體系在一定程度上可以調(diào)節(jié)體系的pH值，使得在一個(gè)合適的酸堿性范圍內(nèi)目標(biāo)離子有更好的峰型。

3.2 提取溶劑的選擇

在農(nóng)藥目標(biāo)分子的前處理過(guò)程中，常用的萃取溶劑有甲醇、乙腈、乙酸乙酯等。甲醇雖對(duì)農(nóng)藥分子有很好的溶解性，但甲醇是一種質(zhì)子性溶劑在提取農(nóng)藥分子的同時(shí)也很容易將樣品中的醇類(lèi)、多酚、有機(jī)酸等物質(zhì)提取出來(lái)。茶葉樣品中既有較多的茶多酚等物質(zhì)，同時(shí)也含有沒(méi)食子酸等一些有機(jī)酸物質(zhì)，采用甲醇作為提取茶葉樣品中的農(nóng)藥分子，會(huì)對(duì)后續(xù)的凈化過(guò)程造成一定的影響。乙睛作為一種極性較大的溶劑、穿透力強(qiáng)，對(duì)農(nóng)藥分子的提取效率高，并且用乙腈作為提取溶劑可以減少維生素、色素等中等極性雜質(zhì)的溶出，因此被廣泛用于殘留分析中目標(biāo)分子的提取。如用乙酸乙酯作為提取溶劑，最后需氮吹轉(zhuǎn)溶劑為乙腈或者甲醇進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜分析，會(huì)使得前處理時(shí)間變長(zhǎng)。因此綜合考慮，采取乙腈作為提取溶劑。

表1 13種殺菌劑檢測(cè)的質(zhì)譜參數(shù)

3.3 分散固相萃取劑的選擇

在樣品前處理過(guò)程中常用的固相萃取劑有PSA、C18及GCB。PSA是含有氨基基團(tuán)的強(qiáng)極性分子，能夠通過(guò)強(qiáng)的吸附及離子交換過(guò)程將與基質(zhì)中的多酚、有機(jī)酸、糖類(lèi)等含有羥基或者羧基的極性分子除去。C18由于分子中鍵合十八烷基，對(duì)極性較小的分子具有良好的吸附作用，能夠去除基質(zhì)中的色素、維生素等物質(zhì)。GCB則對(duì)色素有良好的去除能力。考慮到茶葉基質(zhì)中有茶多酚、有機(jī)酸、維生素及色素等物質(zhì)，因此在實(shí)驗(yàn)中考慮將上述吸附劑進(jìn)行組合對(duì)樣品前處理凈化。在實(shí)驗(yàn)中以茶葉樣品為基質(zhì)加入50 μg/kg混標(biāo)溶液，考察了不同用量固相萃取劑的凈化效果及回收率情況：（1）25 mg PSA+25 mg C18+10 mg GCB（2）50 mg PSA+50 mg C18+10 mg GCB（3）75 mg PSA+75 mg C18+10 mg GCB。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：以乙睛為提取溶劑的情況下，第（2）、（3）兩種吸附劑綜合使用效果都較好,能夠較好的對(duì)樣品前處理去除雜質(zhì)，并且目標(biāo)分子的回收率均在75%以上。另外也考察了PSA和C18用量不變時(shí)，改變GCB用量?jī)艋Ч牟煌海?）50 mg PSA+50 mg C18+5 mg GCB （5）50 mg PSA+50 mg C18+10 mg GCB（6）50 mg PSA+50 mg C18+15 mg GCB。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，加入 10 mg GCB即可很好的去除色素等雜質(zhì)。因此，綜合考慮實(shí)驗(yàn)成本、凈化效以及對(duì)回收率的影響，實(shí)驗(yàn)中采用50 mg PSA+50 mg C18+10 mg GCB吸附劑組合進(jìn)行樣品的凈化處理。

3.4 方法評(píng)價(jià)

將空白樣品經(jīng)固相萃取劑分散提取得到基質(zhì)凈化液，配制13種殺菌劑的基質(zhì)匹配混標(biāo)溶液，注入超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。以目標(biāo)物特征離子色譜峰響應(yīng)信號(hào)峰面積（y）為縱坐標(biāo)，目標(biāo)化合物的基質(zhì)匹配溶液濃度（μg/L）x為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)特征離子色譜峰信號(hào)的3倍信噪比（S/N≥3）確定方法的檢出限，根據(jù)各目標(biāo)化合物的響應(yīng)情況在茶葉基質(zhì)中進(jìn)行低、中、高3個(gè)濃度水平的加標(biāo)。結(jié)果表明：13殺菌在0.5 μg/L～100 μg/L濃度范圍內(nèi)基質(zhì)匹配曲線線性關(guān)系良好（r≥0.995)，方法靈敏度高，目標(biāo)化合物的檢出下限在 0.08～0.7 μg/kg之間。不同濃度水平加標(biāo)相應(yīng)平均回收率為70.1%～106.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在 1.2%～7.6%之間（表 2）。

4 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采集茶葉樣品40余份進(jìn)行了殺菌劑殘留的分析，發(fā)現(xiàn)1份茶葉樣品中有苯醚甲環(huán)唑殘留，含量為0.056 mg/kg，陽(yáng)性樣品的MRM離子色譜圖如圖1所示。雖有檢出，但未超出食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限量規(guī)定（標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定茶葉中苯醚甲環(huán)唑最大殘留限量為10 mg/kg）[2]。

圖1 陽(yáng)性樣品的苯醚甲環(huán)唑MRM離子色譜圖

表2 13種殺菌劑的平均加標(biāo)回收率和檢出限（n=6）

5 結(jié)論

本研究運(yùn)用分散固相萃取前處理法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立了茶葉中多菌靈、三唑酮、腈菌唑、苯醚甲環(huán)唑等13種殺菌劑殘留的檢測(cè)方法。該方法前處理簡(jiǎn)單，方便快速，具有良好的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，可用于茶葉中殺菌劑殘留的同時(shí)分析，有利于農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的保障。