基質金屬蛋白酶8與Ⅱ型膠原在頸椎間盤退變髓核組織中的表達及意義

洪澤亞 肖耀廣 李志鋼 王永東

（1.湖北省中西結合醫院骨外科，武漢 430000；2.內蒙古醫科大學附屬人民醫院骨科，呼和浩特 010000）

【關鍵字】金屬蛋白酶類；Ⅱ型膠原；頸椎間盤退變髓核組織

目前公認頸椎病的根源是椎間盤退行性變（in?tervertebral disc degenera-tion，IDD）、椎間盤破裂脫出等壓迫神經、脊髓或椎動脈而引起的各種癥狀[1]。椎間盤是椎體間的鏈接結構，髓核位于椎間盤中央偏后[2]。髓核內Ⅱ型膠原的降解是髓核退變的主要原因[3，4]。蛋白聚糖和Ⅱ型膠原（Collagen typeⅡ）為細胞外基質的重要成分，彈性蛋白和水也是其組成成分[5,6]。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是細胞外基質發生降解的重要酶，MMP-8 是MMPs 家族中重要成員，又稱膠原酶2、嗜中性膠原酶[7]。國外有研究證明MMP-8可以降解膠原蛋白，從而導致組織退化重構，比例失衡。關于MMP-8 在心血管疾病、支氣管擴張等疾病中的研究較多，但關于MMP-8在椎間盤退變中的研究目前較少。雖然有研究發現在椎間盤髓核組織中存在MMP-8[8]，但未進一步描述MMP-8在退變和正常頸椎間盤髓核組織的表達情況及其意義。因此，本研究擬探討MMP-8和Ⅱ型膠原在正常和退變的頸椎間盤髓核組織中的表達和意義，為進一步了解頸椎間盤髓核退變的機制及明確頸椎間盤退變的病因提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 標本來源與臨床資料

1.1.1 研究組：選取2017 年6 月至2018 年6 月湖北省中西結合醫院、內蒙古醫科大學附屬人民醫院因頸椎病（主要為頸椎間盤突出癥）行手術治療的患者。納入標準：①術前診斷為頸椎病神經根型或脊髓型頸椎病，同時具有相應的癥狀和體征，且病程超過1年以上；②術前頸椎MRI顯示頸椎間盤髓核有退變、突出壓迫神經根或脊髓（Pfirrmann 分級2～5 級）[9]；③肌電圖提示相應神經根節段有病變；④手術摘除病變頸椎間盤髓核。排除標準:①有椎間隙感染表現；②因骨折、脫位和腫瘤等導致脊髓神經損傷。

最終共納入60 例患者。其中男45 例，女15 例，年齡30～62 歲，平均年齡（42.9±12.3）歲，包括神經根型30 例（C4-55 例，C5-610 例，C6-715 例），脊髓型30 例（C5-615例，C6-715例）。每例患者取術中摘除的頸椎間盤髓核1個，共60個。

1.1.2 對照組：選取同期相同醫院因頸椎骨折或脫位行手術復位融合內固定治療的患者。納入標準：①頸椎骨折或脫位的患者；②傷后6 h至3 d行手術治療；③術前頸椎MRI顯示椎間盤無退變信號（Pfirrmann分級1級）。排除標準:術前有頸椎病相關癥狀及其他相關疾病。

最終共納入10 例患者。其中男7 例，女3 例，年齡21～36 歲，平均年齡（28.3±4.6）歲。每例患者取術中摘除的頸椎間盤髓核1 個，共10 個，其中C4-54 個，C5-65個，C3-41個。

本研究經湖北省中西結合醫院、內蒙古醫科大學附屬人民醫院倫理委員會許可，并獲得患者的知情同意。經兩家醫院病理專家確診，研究組標本均為頸椎間盤退變髓核組織，對照組標本均為頸椎間盤正常髓核組織。

1.2 主要實驗試劑與儀器

UltrasensitiveTMS-P超敏試劑盒（福州邁新生物技術有限公司），DAB 顯色試劑盒：試劑A：DAB 緩沖液（20×）、試劑B：DAB 底物（20×）、試劑C：DAB 色原（20×）（福州邁新生物技術有限公司），一抗兔抗人MMP-8多抗濃縮型抗體（北京博奧森生物技術有限公司），TKY-BMB 型石蠟包埋機，德國LEICA RM2235型切片機，Olympus CX41型顯微鏡，江蘇捷達JD-108圖像分析儀，奧林巴斯BX41P偏光顯微鏡。

1.3 主要實驗方法

髓核組織標本獲取后洗去血跡，常規固定（10%中性甲醛溶液），石蠟包埋，4 μm 連續切片。分別進行HE、天狼猩紅飽和苦味酸及免疫組化染色。HE染色后光鏡下觀察頸椎間盤髓核組織結構。偏振光鏡下觀察天狼猩紅飽和苦味酸染色后頸椎間盤髓核組織膠原類型及分布特點，其中Ⅰ型膠原呈黃色與紅色，Ⅲ型膠原呈綠色，Ⅱ型膠原纖維有弱的雙折光性，為疏松網狀分布，呈多種色彩[10]。免疫組化染色使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內抗原，并對其進行定性、定量分析[11]。MMP-8 免疫組化染色陽性表達為棕黃色（細胞質及胞外），弱陽性表達為淺棕黃色，陰性表達為無著色。Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性表達為棕色，主要在軟骨樣細胞周圍基質內出現，弱陽性表達為淺棕黃色，陰性表達為無著色。采用畫分割光密度分析，平均光密度值越小表示著色越淺，平均光密度值越大則表示著色越深。

1.4 統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件進統計學分析。采用獨立樣本t檢驗比較頸椎間盤正常與退變髓核組織MMP-8、Ⅱ型膠原的平均光密度值差異；采用Pearson相關分析法分析頸椎間盤退變髓核組織MMP-8與Ⅱ型膠原表達的相關性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色結果

頸椎間盤正常髓核組織的軟骨細胞有不規則的軟骨陷窩，細胞呈卵圓形，髓核細胞多孤立存在于細胞陷窩內，少見多核巨細胞及細胞團，細胞核呈橢圓形，纖維網排列致密，結構規整，無斷裂及鈣化（圖1A）。頸椎間盤退變髓核組織纖維排列紊亂或相互交叉融合，結構不規整、凌亂，出現斷裂及纖維軟骨組織鈣化（局部深藍部分）（圖1B）。

2.2 天狼猩紅飽和苦味酸染色結果

頸椎間盤正常髓核組織內可見膠原纖維含量高，膠原排列致密連續，無斷裂，主要是Ⅱ型膠原，纖維環處為Ⅰ型膠原，Ⅱ型膠原在軟骨樣細胞處顯色（圖2A）。頸椎間盤退變髓核組織膠原顯色弱，各型膠原含量均減弱，降解嚴重，僅有少量的Ⅰ型膠原和極少量Ⅱ型膠原（圖2B）。

2.3 免疫組化染色及定量分析結果

頸椎間盤正常髓核組織內MMP-8主要是陰性表達（圖3A），Ⅱ型膠原主要是陽性表達（圖4A）。頸椎間盤退變髓核組織內MMP-8 主要是陽性表達，且在細胞核內外均有表達（圖3B），Ⅱ型膠原主要是弱陽性表達或無表達（圖4B）。

定量分析結果顯示，與頸椎間盤正常髓核組織比較，退變髓核組織MMP-8的表達較多，而Ⅱ型膠原的表達較少，且差異均有統計學意義（表1）。

2.4 頸椎間盤退變髓核組織MMP-8與Ⅱ型膠原表達的相關性

圖1 成人頸椎間盤髓核組織（HE染色，×200）

圖2 成人頸椎間盤髓核組織（天狼猩紅飽和苦味酸染色，10×10）

Pearson 相關分析結果顯示，頸椎間盤退變髓核組織MMP-8表達與Ⅱ型膠原表達呈負相關（r=-0.713，P＜0.01），即頸椎間盤退變髓核組織MMP-8 表達越高，Ⅱ型膠原表達反而越低。

圖3 成人頸椎間盤髓核組織MMP-8表達（SP染色，×200）

圖4 成人頸椎間盤髓核組織Ⅱ型膠原表達（SP染色，×200）

表1 頸椎間盤正常與退變髓核組織MMP-8蛋白、Ⅱ型膠原表達比較（）

表1 頸椎間盤正常與退變髓核組織MMP-8蛋白、Ⅱ型膠原表達比較（）

3 討論

椎間盤細胞的數量減少和細胞外基質的降解是其發生退變的主要原因[11]。椎間盤細胞外基質結構主要由水、蛋白聚糖、彈性纖維和Ⅰ、Ⅱ型膠原構成，其中髓核組織內以Ⅱ型膠原及蛋白聚糖為主，其退變的過程主要是Ⅱ型膠原及蛋白聚糖的表達減少[12,13]，使膠原基質負荷增大，加快基質降解和正常功能喪失，椎間盤生物力學發生改變[14-16]，從而導致椎間盤和脊柱發生一系列病理變化。本研究組織學觀察結果可見，在退變椎間盤組織中纖維環板層狀結構破壞，髓核組織排列紊亂或相互交叉融合，整個纖維環變得粗糙甚至出現鈣化。

Attila 等[17]發現成人髓核內主要細胞是軟骨細胞，軟骨細胞是Ⅱ型膠原表達的主要細胞，所以成人正常髓核內膠原主要是Ⅱ型膠原。髓核組織變性的本質是Ⅱ型膠原減少，從而使椎間盤正常結構發生改變。Smith 等[18]通過大量的實驗證明，在退變的椎間盤髓核組織中Ⅱ型膠原的表達隨著退變程度的加重逐漸減少。王兆豐等[19]將60例椎間盤標本進行免疫組化染色，結果顯示正常椎間盤髓核組織中Ⅱ型膠原表達較退變髓核組織中表達明顯增高，并且推測Ⅱ型膠原減少可能使椎間盤組織退變。本研究通過天狼猩紅飽和苦味酸及免疫組化染色發現，頸椎間盤退變髓核組織Ⅱ型膠原較正常髓核組織明顯減少。頸椎間盤退變髓核組織內各型膠原均減少，降解嚴重，主要是Ⅰ型膠原和極少數Ⅱ型膠原，而且膠原走行紊亂，連續性差。免疫組化定量分析結果也顯示，頸椎間盤退變髓核組織Ⅱ型膠原表達比正常髓核組織少，椎間盤髓核組織的退變與Ⅱ型膠原表達減少可能有著直接關系，Ⅱ型膠原有減緩髓核退變的作用。

MMPs通過降解細胞外基質使椎間盤發生生理和病理的改變[20]。該過程是受其與金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitors of matrix metalloproteinases,TIMPs）之間的平衡調控[21,22]來完成的。MMPs是椎間盤細胞外基質降解的關鍵酶[23]，主要降解細胞外基質的各型膠原和蛋白。MMPs在正常的椎間盤組織中是以無活性的酶原形式分泌，其蛋白水解酶活性的激活主要是位于細胞間質內N端結構域。并且有些MMPs可通過相互作用激活其他蛋白酶。人體有很多方式調節MMPs的產生和活性，如炎性介質、激素、細胞因子、腫瘤壞死因子等影響MMPs的分泌和激活[24]。

MMP-8 是一種能夠降解完整間質膠原的酶，與MMP-1 的結構和功能十分相似[25]。以前學者認為MMP-8 對Ⅰ型膠原降解有較強的作用，但現在研究表明MMP-8 對Ⅰ、Ⅱ型膠原降解均有較強的作用[26]。MMP-8 不僅直接降解Ⅱ型膠原，而且還可以激活其他MMPs 如MMP-3，加速膠原的降解，并調節細胞因子如腫瘤因子、白細胞介素8 等的分泌，而這些因子又可以激活其他MMPs，加速細胞外基質的降解[27]。本實驗也證實了MMP-8 降解Ⅱ型膠原的結論：Pearson相關分析結果顯示，頸椎間盤退變髓核組織MMP-8表達與Ⅱ型膠原表達呈負相關，即MMP-8表達越高，Ⅱ型膠原表達反而越低，MMP-8可能是降解Ⅱ型膠原的因素之一。Beatrice等[28]通過對24例行椎體融合術的患者退變的椎間盤標本中的MMPs 進行免疫組化及PCR 實驗，得出MMP-8 在退變的椎間盤內有一定的表達，其中18 例中度表達，6 例強烈表達，并且得出MMP-8 表達與MMP-1 表達無相關性，與MMP-13表達呈負相關，與疼痛時間呈正相關。故推測MMP-8表達與椎間盤退變有一定的關系。Wei?ler 等[29]對因椎間盤病變而行椎體融合術的患者髓核組織進行MMPs 的測定，發現MMP-8 表達與髓核組織退變有一定的相關性。Vo等[30]也證明在退變椎間盤組織中MMP-8表達較正常椎間盤組織高。本研究免疫組化定量分析結果也證明，頸椎間盤退變髓核組織MMP-8 表達多于正常髓核組織，且差異有統計學意義，說明MMP-8參與了椎間盤髓核組織的退變。

綜上所述，本研究通過與頸椎間盤正常髓核組織對比，發現MMP-8 在退變髓核組織中的表達明顯增高，是頸椎間盤髓核組織退變的重要調節因子，對降解椎間盤髓核組織細胞外基質中的Ⅱ型膠原有著重要的作用，且兩者的表達呈負相關，為MMP-8抑制劑減緩頸椎間盤退變提供了理論支持。但本研究樣本量較小，對其他生物因素如白細胞介素等如何調節MMP-8的分泌未進行研究，對MMP-8及Ⅱ型膠原在各種頸椎病退變椎間盤髓核組織中表達進行差異性比較還有待進一步研究。