兩種不同熒光示蹤劑神經追蹤效果比較

程子娟 葉桂山 戈玉梅 曹 娜 李肇蕤 劉漫君 朱 琳 夏春波▲

1.桂林醫學院人體解剖學教研室，廣西桂林 541004；2.桂林醫學院附屬醫院，廣西桂林 541001

熒光示蹤劑具有靈敏性、可靠性及可同時追蹤多重纖維聯系的特點，是一類有效且應用前景廣闊的神經通路追蹤方法。其中伊文思藍（Evans Blue，EB）和DiI[1]（1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocar- bocyanine perchlorate，DiI）是目前較為常見的熒光示蹤劑，在神經示蹤研究中均證明了其有效性，但兩者示蹤效果的詳細特性和對比尚不清楚，在本項研究中，將EB 和DiI 注入大鼠海馬進行標記，分析比較腦橋標記細胞的熒光強度和數目，為神經示蹤研究提供客觀參考和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

健康SD 大鼠40 只，體重（250±20）g，購于桂林醫學院科學實驗中心，合格證號：SCXK 桂2007-000。隨機分成EB 組（n=20）和DiI 組（n=20）。

1.2 主要試劑和設備

EB、DiI 均 購 于 美 國Sigma 公 司，DMSO 購于上海碧云天生物有限公司，腦立體定向儀（日本SR-6），冰凍切片機（德國LEICA CM1860 UV），熒光顯微鏡（日本OlympusIX71FL）。

1.3 神經示蹤劑注射

大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3mL/kg），參照大鼠腦立體定位圖譜，選取大鼠左側海馬坐標前囟后3.6mm，中線右旁開3.2mm，硬膜下3.5mm，用顱骨鉆在注射點顱骨鉆孔，分別緩慢注射DiI（2.5mg/mL，DMSO）和EB（5%，DIW）各0.3μL，留針10min。將大鼠飼養72h 后，再次麻醉，用鈍針頭自心尖處小于10°進針插入升主動脈固定，剪開右心耳，先迅速注入PBS 溶液400 ～500mL，使肝臟顏色變淺至發白，右心耳流出液無色后，4%多聚甲醛200mL 先快后慢灌注固定，隨后立即取腦，置于4%多聚甲醛溶液中4℃條件下固定，24h 后梯度蔗糖脫水。

1.4 樣本采集及鏡下觀察

將脫水完成的腦組織用游標卡尺測量后分段切取，常規冰凍切片，置于4℃冰箱濕盒避光保存。使用熒光顯微鏡觀察注射部位腦切片，將注射點準確位于海馬的大鼠腦切片分析，摒除定位不準或熒光劑溢出者。

1.5 統計學處理

同一高倍顯微鏡下熒光標記細胞數據采用SPSS 18.0 軟件處理，用）表示計量資料，DiI 和EB 組熒光強度差異采用獨立樣本t 檢驗，P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 熒光標記細胞形態學觀測結果

大鼠海馬注射DiI，腦橋部見形態完整，輪廓清晰，對比鮮明的熒光標記細胞；注射EB，腦橋部熒光標記細胞輪廓不甚明朗，核未清晰顯示，對比不明顯。見圖1。

圖1 兩種不同神經示蹤劑追蹤效果（0.3μL，×200，↓：腦橋標記細胞）

2.2 熒光強度測定結果

使用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統對同一解剖部位，5 個不同視野標記細胞進行計量、分析熒光強度，經SPSS 18.0 軟件處理，t 檢驗分析DiI 和EB 組數據，結果顯示DiI 組熒光強度高于EB 組，差異有統計學意義（P ＜0.01），兩組標記細胞的數量差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 DiI和EB平均熒光強度和標記細胞數量測定結果

表1 DiI和EB平均熒光強度和標記細胞數量測定結果

3 討論

目前研究顯示，神經解剖束路追蹤[2]可以闡明神經系統的解剖聯系，借助示蹤劑了解神經元之間的傳導通路、鑒別特定神經軸突投射的目標神經元定位等[3]。隨著熒光成像技術及敏感熒光示蹤劑的發展為分析神經元回路提供了許多新的途徑。現有神經示蹤劑中，不同示蹤劑的追蹤效果差異較大，各有優缺點，選擇合適的示蹤劑，對神經通路研究十分關鍵。

DiI 作為最近引用的示蹤劑，紫紅色羰花青熒光染料，在549nm 激發光下可以產生發射波長為565nm 的紅色熒光，1986 年Honig 等[4]首次確定DiI 可以示蹤活體組織中的神經通路，其在固定組織中也可進行順行和逆行示蹤[5-6]。它熒光強，穩定可靠，無毒性，神經元的電生理幾乎不受影響，有良好的神經軸突特異性，對周圍纖維影響小，少見染料在細胞間遷移。DiI 已被廣泛應用到生物體神經傳導通路的示蹤研究中[7-11]。EB 是早期發現的熒光示蹤劑，常應用于示蹤神經通路[12-13]和觀察血腦屏障的完整性[14-15]，它在藍光光波的激發下發出紅色熒光，激發波長 545 ～580nm，發射波長 600nm，熒光顯微鏡下可直接觀察，簡便精確，是追蹤神經通路的可靠方法。本研究分析比較DiI 和EB 兩種熒光追蹤劑的詳細標記特性，為神經示蹤研究提供實驗依據。本實驗采用腦立體定位技術將熒光標記物注入大鼠海馬，有研究報道[12]注射EB 后，熒光劑擴散范圍和注射體積有關。本實驗注射熒光劑體積確定，將示蹤劑定為唯一的變量，標記結果顯示，兩種示蹤劑均可用于神經示蹤，DiI 標記細胞形態完整，輪廓清晰，對比鮮明，持續較長時間不易淬滅。EB 標記神經元輪廓不甚明朗，從形態學上證實了DiI 的神經示蹤效果優于EB，推測可能是由于DiI 的親脂性及擴散方式與EB 有差異的緣故。此外，熒光標記在腦橋處效果更佳，與常麗榮等[16]的研究結果基本一致，再次證實了海馬與腦橋的纖維聯系。DiI 和EB 標記神經元數目無顯著性差異，但DiI 組標記熒光強度顯著高于EB 組。因此本研究認為DiI 較EB 而言可能更適合應用于神經形態學的研究，為神經定位、標記以及神經通路研究提供參考和依據。