在豬藍耳病病毒和豬圓環病毒感染豬場利用豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗控制豬瘟的案例分析

劉武剛，張海雷，周緒斌，曾容愚

（天康生物股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830001）

豬瘟(CSF)是一種由豬瘟病毒(CSFV)引起的烈性傳染病，也是危害我國養豬業的重要疫病。豬瘟病毒是黃病毒科瘟病毒屬的一種有囊膜的正股單鏈RNA 病毒。我國在20 世紀50 年代就研發了豬瘟兔化弱毒活疫苗(C 株)來預防豬瘟的暴發，取得較好的效果。近幾年來，由于我國的規模化豬場已經大規模的免疫了豬瘟活疫苗，使得豬瘟的流行特點已經發生了顯著的變化，主要以非典型、亞急性、慢性或者隱形感染為主，主要表現為無臨床表現的母豬帶毒垂直傳播及豬群中水平傳播。母豬溫和型豬瘟臨床癥狀不明顯，但是帶毒豬會持續性地散毒，通過胎盤把病毒垂直傳播給仔豬，使得仔豬在胚胎時期就感染豬瘟病毒，造成其天然免疫耐受，在出生前就感染豬瘟病毒；并且水平傳播給沒有帶毒仔豬從而造成仔豬的發病死亡，這種母豬帶毒綜合征是目前豬場豬瘟控制不穩定的主要原因[1]。豬瘟兔化弱毒疫苗已被證明可誘導對CSFV 感染產生完全的保護作用，并已廣泛用于控制豬的CSF，特別是在高度流行的地區。盡管如此，仍然有一些其他的因素影響現有豬瘟弱毒疫苗的免疫效果，從而導致免疫失敗，這些因素包括母源抗體水平[2,3]，接種時間[4]，接種方案，豬的日齡及與其他病原共感染等情況[5]。

在豬瘟的防控過程中，免疫抑制性疾病一直十分困擾養豬業。豬場尤其是規模化豬場一旦感染免疫抑制性疾病，會很大程度影響豬瘟弱毒疫苗的免疫效果。多項研究表明PRRSV 可能對宿主免疫反應產生負調節作用。感染PRRSV 的豬通常表現為長時間的病毒血癥和持續性感染。S. Suradhat 通過試驗證實在PRRSV 感染的急性期進行豬瘟免疫可能導致疫苗接種失敗。PRRSV 可能是通過在感染初期宿主淋巴組織微環境中IL-10 的增多使體液免疫和細胞免疫功能受損，這也是PRRSV 可以抑制豬瘟免疫效果的原因。PRRSV 感染顯著抑制豬瘟疫苗效力的結果值得養豬業高度重視，特別對同時存在豬瘟和豬藍耳病流行的國家在進行豬瘟免疫時具有很大的啟示[6]。

PCV2 是另一種中國豬場常見的免疫抑制性疾病，是引起仔豬斷奶后多系統衰竭綜合征（PMWS)的主要原因之一。PCV2 感染能降低PRRSV 疫苗的保護效果，可以干擾宿主對豬偽狂犬病的免疫應答。PCV2 介導的淋巴細胞活化干擾降低了體液免疫和CMI 的活化，也與CSFV 中和抗體的產生及抑制CSFV特異性細胞增殖有關。最新的研究顯示，如果豬場在接種疫苗前發生PCV2 感染，那么豬場CSFV 的感染壓力將顯著增加，豬場免疫CSFV疫苗對野毒的防治效果大大降低[7]。

1 豬場和豬群發病的背景

北京某規模化種豬場，存欄2 000 頭基礎母豬，從2017 年5 月份開始，出現40 ～50 日齡保育豬生產不穩定，發病豬臨床表現為發燒，聚堆，被毛粗亂，關節腫大，倒地后四肢劃水，消瘦，其中倒地劃水的比例占30%，大部分豬存在淚斑，結膜炎。每批豬的發病率在20%～40%，死亡率10%～20%。剖檢癥狀主要表現為肺臟間質性肺炎、腹股溝淋巴結呈大理石樣出血、腎臟溝壑加深變形、脾臟出現邊緣梗死等癥狀，詳細見圖1。

使用豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗免疫前，豬場分離血清送實驗室進行豬瘟抗體測定，檢測結果顯示，豬瘟抗體滴度非常低，4 周齡首免后，隨著仔豬周齡增加，豬瘟抗體阻斷率降低，離散度增大，陽性率降低，甚至到8 周齡，抗體平均阻斷率14.5%，離散度64.5%，陽性率0。具體檢測結果如圖2、圖3。

將場內發病豬病料送實驗室進行病原檢測，豬藍耳病病毒和豬圓環病毒核酸檢測結果為陽性，疑似場內有豬藍耳病病毒和豬圓環病毒感染。具體檢測結果見表1。

2 疫苗試驗應用方法

圖1 發病豬只臨床表現以及解剖臨床癥狀

圖2 2018 年3 月豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗免疫前生長豬豬瘟抗體平均阻斷率/離散度

圖3 2018 年3 月豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗免疫前生長豬豬瘟抗體陽性率

表1 豬瘟病毒、豬藍耳病病毒、豬偽狂犬病野毒、豬圓環病毒2 型核酸檢測結果

試驗組分為A/B 兩組，并做兩個重復，A 組分場進行豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗免疫，B 組分場進行豬瘟ST 弱毒疫苗免疫，免疫途徑與免疫劑量按照疫苗說明書進行。生長豬對比試驗時，A 組分場連續兩批次免疫豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗，B 組分場免疫豬瘟ST疫苗，按照仔豬豬瘟免疫程序進行，28 日齡第1 次免疫，63 日齡第2 次免疫。種豬群對比試驗時，按照種豬群豬瘟普免免疫程序進行，A 組分場全場免疫豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗，B 組分場免疫豬瘟ST疫苗。試驗豬的飼養管理以及其他疫苗免疫均按本場原有程序進行，試驗期間如有明顯疾病發生，如嚴重腹瀉，肢體傷殘等，均予以淘汰。

3 采血與檢測

生長豬每組在首免后4 周進行采血。種豬群每組按胎次免疫后1個月隨機抽取35 頭采血。利用豬瘟阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒檢測豬瘟抗體。

4 判定標準

豬瘟抗體ELISA 檢測成立條件：陰性對照的平均OD450應大于0.50。陽性對照的阻斷率應大于50%。結果判定標準：如果被檢樣本的阻斷率大于或等于40%，該樣本就可以被判為陽性(有CSFV 抗體存在)。如果被檢樣本的阻斷率小于或等于30%，該樣本就可以被判為陰性(無抗CSFV 抗體存在)。如果被檢樣本的阻斷率在30%～40%之間，就應在數日后再對該動物進行重測。如果重測結果仍為可疑，就應用血清中和試驗方法鑒定。

5 試驗結果

1)生長豬方面，同等條件下進行免疫對比，連續2 批。豬藍耳病病毒感染，豬圓環病毒感染對豬瘟ST 疫苗和豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗的影響見圖4。試驗前，檢測生長豬免疫豬瘟ST 疫苗效果見圖2和圖3，4 周齡首免后，一直檢測到8 周齡，平均抗體阻斷率逐漸下降，到8 周齡時為14.5%，陽性率為0，雖然對比試驗中，首免后4 周，第一批次平均阻斷率42.69%，陽性率60%。第二批次平均阻斷率33.99%，陽性率44%，比試驗前摸底數據有好轉，但仍然受豬藍耳病病毒、豬圓環病毒感染導致抗體不理想。然而，豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗免疫組，首免后4 周，第一批次平均阻斷率73.68%，陽性率100%。第二批次平均阻斷率71.22%，陽性率93%。數據表明，豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗受豬藍耳病病毒、豬圓環病毒感染影響較小，可減少豬只豬瘟的免疫空窗期。

圖4 2018 年4 月生長豬豬瘟抗體檢測對比

圖5 2018 年5月種豬豬瘟抗體檢測對比

2)種豬群方面，同等條件下進行免疫對比，豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗免后1 個月平均阻斷率92.82%～95.40%，離散度≤7.69%，豬瘟ST 苗免疫后1 個月平均阻斷率82%～88%，離散度7.84%～22.86%。種豬群使用后對比，平均阻斷率有了進一步的提高，離散度有了進一步的降低，總之，豬瘟抗體的免疫效果有了進一步的提升。具體數據如圖5。

3)生產成績提升，從3 月份開始更換豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗，全群換苗2 個月后，從5 月份開始，保育階段仔豬育成率持續保持97%及以上。平均日增重也有了明顯增高，最高可達119 g/d，生產成績有了明顯的提升。具體數據如圖6。

6 討論

從20 世紀50 年代中國研發成功舉世聞名的豬瘟兔化弱毒疫苗(即C 株)，該疫苗被公認為是最有效的豬瘟疫苗，但關于C 株疫苗在機體內的作用機制，仍然還沒有完全研究透徹。而S. Suradhat等在2005 年的發表文章中已證明PRRSV 感染可嚴重影響了豬只對CSFV 抗體反應的誘導[9]。并且Yu-Liang Huang 等的研究表明了PCV2的感染降低了LPC 豬瘟疫苗的免疫效果，不僅可以干擾CSFV 野毒侵入養豬場，而且也增加了CSF 流行區CSF 防治的難度[10]。

如圖2 數據顯示，感染豬藍耳病病毒和豬圓環病毒，導致豬瘟弱毒疫苗4 周齡首免后，一直檢測到8 周齡，平均抗體阻斷率逐漸下降，到8 周齡時為14.5%，陽性率為0，雖然對比試驗中，首免后4周，第一批次平均阻斷率42.69%，陽性率60%。第二批次平均阻斷率33.99%，陽性率44%，比試驗前摸底數據有好轉，但仍然受豬藍耳病病毒、豬圓環病毒感染導致抗體不理想(見圖4)。這也解釋了目前保育、育肥豬群豬瘟抗體水平低下的原因。

豬瘟病毒囊膜糖蛋白E2 是豬瘟病毒的主要的保護性抗原蛋白，單獨免疫E2 蛋白即可避免豬感染豬瘟病毒。E2 蛋白上的中和性表位在 CSFV 毒株中相對保守，使得針對E2 蛋白基礎上開發的亞單位疫苗不僅廣泛地保護豬對抗CSFV 野毒株，而且可以通過檢測抗 Ems 的抗體將免疫和感染的豬區分開[8]，這就為豬瘟的凈化開辟了新的途徑。E2 蛋白已被證實是一個有效的可刺激機體產生主要中和抗體的免疫蛋白，并且文中研究結果表明，在豬群受豬藍耳病病毒、豬圓環病毒2 型感染的情況下，豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗免疫并未受到明顯干擾，首免后4 周，第一批次平均阻斷率73.68%，陽性率100%。第二批次平均阻斷率71.22%，陽性率93%(見圖4)。

圖6 左圖保育階段3-10 月份育成率，右圖保育階段3-10 月份平均日增重

豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗免疫效果明顯優于豬瘟ST 苗，可以突破免疫抑制的限制，在豬群存在豬藍耳病和豬圓環病毒病等免疫抑制性疾病的情況下，仍可以穩定提高豬瘟抗體水平，提供有效保護，提升生產成績，這就為復雜豬病形勢下豬瘟的防控提供了新的工具和方法。