趨化因子CXCL13通過誘導星形膠質細胞活化參與骨癌痛的發生

卜慧蓮，郭海明，焦鵬飛，徐富興，樊肖沖

(1．鄭州大學第一附屬醫院疼痛科，河南 鄭州 450052；2.鄭州大學第一附屬醫院麻醉科，河南 鄭州 450052)

骨癌痛是由腫瘤發生骨轉移引起的劇烈慢性疼痛，也是臨床上的一個難治性問題，容易發生骨轉移的惡性腫瘤有乳腺癌、肺癌、前列腺癌等。骨癌痛的發生機制尚不完全明確，主要包括外周敏化和中樞敏化。趨化因子在骨癌痛中樞敏化中發揮著重要作用，本課題組的前期研究結果顯示，骨癌痛大鼠脊髓內趨化因子C-X-C配體13(chemokine C-X-C motif ligand 13, CXCL13)的表達明顯升高，鞘內注射CXCL13重組蛋白使其外源性表達升高，可導致大鼠痛閾的快速下降，提示其具有致痛作用，而鞘內注射小干擾核糖核酸(small interference ribonucleic acid, siRNA)特異性抑制脊髓內趨化因子C-X-C受體5(chemokine C-X-C motif receptor 5, CXCR5)的表達，可對抗骨癌痛的發生過程[1]，CXCR5主要表達于星形膠質細胞[2]，我們推測CXCL13可能通過干預星形膠質細胞活化參與骨癌痛的發生，本研究擬通過動物實驗和細胞實驗2個層面，觀察CXCL13對星形膠質細胞活化的影響，并探討其在骨癌痛發生中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料雌性SD成年大鼠及SD大鼠乳鼠均購自鄭州大學實驗動物中心；胎牛血清、DMEM高糖培養基購自美國Gibco公司；CXCL13重組蛋白購自美國Peprotech公司；CXCR5 siRNA和對照RNA購自上海吉凱基因有限公司；星形膠質細胞抑制劑-氟代檸檬酸購自美國Sigma公司；星形膠質細胞標志物兔抗膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體和Cy3-標記羊抗兔二抗購自美國Millipore公司；Transwell細胞遷移試劑盒購自美國BD公司；EdU細胞增殖試劑盒購自美國GeneCopoeia公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 骨癌痛 大鼠痛閾測定將大鼠分為骨癌痛組、假手術組和正常對照組，參照既往實驗方法[3]，將大鼠Walker256乳腺癌細胞注射至SD大鼠右側脛骨骨髓腔內，假手術組僅注射生理鹽水，在建模后1、3、7、14和21 d采用Von-frey絲測機械痛，分別采用1、2、4、6、8、10和15gVon-Frey絲垂直刺激大鼠右側足底，當大鼠出現突然撤爪、舔爪等表現時即為疼痛陽性反應，記錄出現陽性反應的最低克數，重復3次，取最低值為機械縮爪閾值(paw withdrawl threshold，PWT)。

1.2.2 星形膠質細胞活化 對骨癌痛大鼠痛閾影響的測定建立大鼠骨癌痛模型，將大鼠分為生理鹽水組、氟代檸檬酸組、CXCL13重組蛋白組和氟代檸檬酸-CXCL13重組蛋白組，自建模后1 d開始分別鞘內注射生理鹽水10 μL、氟代檸檬酸1nmol和(或)CXCL13重組蛋白20 ng，在建模后1、3、7、14和21 d的給藥后1 h后測定并記錄PWT值。

1.2.3 測定CXCR5 siRNA 對骨癌痛大鼠脊髓內星形膠質細胞活化的影響將大鼠分為假手術組、骨癌痛組、CXCR5 siRNA組和對照RNA組，分別給大鼠鞘內注射CXCR5 siRNA(2×106IU)和對照RNA(2×106IU)，在病毒注射后7 d建立骨癌痛模型，在建模后14 d處死大鼠，多聚甲醛固定后取脊髓腰膨大，切片30 μm厚度，破膜后孵兔抗GFAP一抗，4 ℃過夜，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌后孵Cy3標記的羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，PBS洗滌后封片，采用德國Leica正置熒光顯微鏡拍照，觀察各組星形膠質細胞活化狀態。

1.2.4 原代星形膠質細胞分離和培養 將出生24 h內的SD大鼠乳鼠消毒后取大腦皮層，用質量分數0.25%胰蛋白酶消化10 min，使組織消化為細胞后，接種到多聚賴氨酸包被的25 cm2培養瓶中，在37 ℃細胞培養箱中使用含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基培養，24 h后全量換液，此后每隔3 d半量換液1次，細胞培養10～14 d左右，可見細胞長滿瓶底，并出現分層現象，底層細胞充分鋪展，接觸緊密，多為扁平，具有多個突起的大細胞(星形膠質細胞)，而上層細胞多為類圓形，遮光性強，邊緣有毛刺樣突起(以小膠質細胞為主)，手搖培養瓶3～5 min，使附著于星形膠質細胞表面的細胞脫落下來，棄去培養基，即可去除小膠質細胞及其他雜細胞。

1.2.5 Transwell細胞遷移實驗 將星形膠質細胞分為生理鹽水組、CXCL13重組蛋白10 ng·mL-1組、CXCL13重組蛋白20 ng·mL-1組、CXCL13重組蛋白50 ng·mL-1組，當培養的星形膠質細胞長到約90%時，棄去培養基后洗滌2次。胰酶消化后加入少量含血清的培養基終止消化，離心5 min。采用移液槍輕輕吹打培養皿底部細胞，將吹打下的細胞收集離心，棄去上清后重懸細胞并計數，然后稀釋至5×106·mL-1，取0.1 mL細胞懸液，分別加入Transwell上室，在Traswell下室加入0.6 mL培養基(分別含生理鹽水，10、20和50 ng·mL-1CXCL13重組蛋白)，在培養箱中37 ℃條件下遷移24 h。將Transwell小室膜上下的細胞用PBS洗滌3次，每次5 min。采用質量分數4%多聚甲醛固定15 min。PBS洗滌3次。將小室上層細胞采用醫用棉簽輕輕擦拭，留下小室下層細胞HE染色，染色后光學顯微鏡下觀察計數，計算相對于生理鹽水組增殖率。

1.2.6 EdU細胞增殖實驗 將星形膠質細胞分為CXCL13重組蛋白10 ng·mL-1組、CXCL13重組蛋白20 ng·mL-1組、CXCL13重組蛋白50 ng·mL-1組，參照EdU細胞增殖試劑盒說明，將細胞以4×104個/孔的密度接種于鋪有多聚賴氨酸包被玻片的24孔板中，于37 ℃培養箱生長黏附5 h，用PBS洗滌后，分別加入生理鹽水，10、20和50 ng·mL-1CXCL13重組蛋白，于37 ℃培養箱內培養24 h，然后在含有10 μmol·L-1EdU培養基中孵育2 h，隨后用PBS洗滌，用質量分數4%多聚甲醛固定30 min，加入50 μL 2 g·L-1甘氨酸中和多聚甲醛，PBS洗滌，破膜后加入100 μL染色反應液，避光室溫孵育30 min，棄去染色反應液，加入100 μL滲透液，PBS洗滌，丟棄滲透液，加入100 μL甲醇加強5 min，PBS洗滌，加入Hoschst反應液，避光孵育30 min，PBS洗滌，熒光顯微鏡觀察拍照，計算細胞增殖率。

2 結果

2.1 各組大鼠PWT變化自建模后3 d開始，與假手術組和正常對照組比較，骨癌痛組大鼠PWT值開始逐漸下降(P<0.05)，提示骨癌痛的發生。見圖1。

2.2 抑制星形膠質細胞對大鼠痛閾及CXCL13誘導的痛覺過敏的影響建模后1、3和7 d，與生理鹽水組比較，CXCL13重組蛋白組大鼠的痛閾明顯下降(P<0.05)，而在14 d和21 d，2組間痛閾差異無統計學意義(P>0.05)，提示CXCL13具有誘導痛覺敏化作用，可以加快骨癌痛的發生。在建模后3d開始，生理鹽水組和氟代檸檬酸-CXCL13重組蛋白組大鼠痛閾開始下降(P<0.05)；在建模后7、14和21 d，氟代檸檬酸-CXCL13重組蛋白組痛閾下降幅度小于生理鹽水組(P<0.05)；而氟代檸檬酸組大鼠的痛閾在各時間點無明顯變化(P>0.05)。這提示氟代檸檬酸干預可預防骨癌痛的發生，并對抗CXCL13重組蛋白的致痛作用。見圖2。

圖1 建模后各組大鼠PWT值的變化

圖2 鞘內注射氟代檸檬酸和(或)CXCL13重組蛋白對骨癌痛大鼠痛閾的影響

與生理鹽水組相比較，1)P<0.05；與CXCL13重組蛋白組相比較，2)P<0.05

2.3 CXCR5 siRNA對骨癌痛大鼠脊髓內星形膠質細胞活化的影響預先給大鼠鞘內注射CXCR5 siRNA減少其表達后，在建模后14 d脊髓內采用免疫熒光檢測GFAP表達情況。結果顯示骨癌痛組和對照RNA組大鼠脊髓內星形膠質細胞明顯活化，表現為數量增加，胞體肥大，突觸增粗等，而假手術組和siRNA組大鼠星形膠質細胞活化明顯較少，表現為細胞數量減少，胞體較小，突觸較細等。見圖3。

2.4 CXCL13重組蛋白對原代星形膠質細胞遷移和增殖的影響通過Transwell實驗觀察不同濃度CXCL13重組蛋白對原代星形膠質細胞遷移的影響，并采用EdU方法檢測CXCL13重組蛋白對原代星形膠質細胞增殖的影響，結果發現，與生理鹽水組比較，10、20和50 ng·mL-1CXCL13重組蛋白均可以使星形膠質細胞遷移的數量增加，且呈遞增趨勢，說明CXCL13可刺激星形膠質細胞的遷移(圖4)。與生理鹽水組比較，10、20和50 ng·mL-1CXCL13重組蛋白均可增加星形膠質細胞增殖率，而20和50 ng·mL-1干預的星形膠質細胞的增殖率大于10 ng·mL-1，說明CXCL13可誘導星形膠質細胞的增殖，且具有一定的劑量依賴性(圖5)。

圖3 各組大鼠脊髓內星形膠質細胞活化狀態

假手術組(A)和siRNA組(C)大鼠星形膠質細胞活化明顯較少，表現為細胞數量減少，胞體較小，突觸較細；骨癌痛組(B)和對照RNA組(D)大鼠脊髓內星形膠質細胞明顯活化，表現為數量增加，胞體肥大，突觸增粗等

圖4 各組原代星形膠質細胞的遷移情況

A:生理鹽水組；B：CXCL13重組蛋白10 ng·mL-1組；C：CXCL13重組蛋白20 ng·mL-1組；D：CXCL13重組蛋白50 ng·mL-1組

3 討論

骨轉移是晚期惡性腫瘤患者常見的合并癥，通常會影響正常骨骼功能，從而使患者日常活動受限，此外，腫瘤骨轉移常引起劇烈疼痛，嚴重影響晚期腫瘤患者生活質量。骨癌痛是由神經病理、炎性機制、壞死等多因素綜合導致的[4]，其發生機制比較復雜，包括外周敏化和中樞敏化，外周敏化機制包括腫瘤的高代謝生長和對周圍組織的破壞，可使局部形成酸性微環境，可直接刺激傷害性感受器產生疼痛信號，此外，局部微環境的改變可導致骨內成骨/破骨的平衡失調，使溶骨細胞活性增強，分泌一系列炎性因子，進而激活痛覺感受器，產生疼痛信號[5]。其中樞機制包括多方面改變，比如骨轉移癌時，內源性阿片系統發生了改變，不同大小背根節神經元中μ阿片受體數目明顯減少，可使阿片類藥物鎮痛作用減弱和阿片類藥物需要量增加；脊髓星形膠質細胞活化；谷氨酸、P物質和興奮性氨基酸等神經遞質的釋放；脊髓內廣動力范圍神經元的敏化；離子通道的功能改變；脊髓內興奮性突觸重塑；包括趨化因子在內的促炎性細胞因子的表達和釋放等[6-8]，這些細胞和分子層面的改變可使脊髓疼痛傳入通路易化，從而發生中樞敏化。

圖5 各組原代星形膠質細胞增殖率

與生理鹽水組比較，1)P<0.05；與CXCL13重組蛋白10 ng·mL-1組比較，2)P<0.05

趨化因子是一類相對分子質量約10 000的小分子細胞因子，其主要功能是介導免疫功能，可誘導正常的白細胞遷移，也可參與炎性反應。在病理情況下，趨化因子還可參與炎性疾病的發生過程[9]；調節胚胎發育、創傷修復、慢性炎癥和惡性腫瘤的生長過程中的血管發生；參與腫瘤轉移和增殖過程[10]；此外，某些趨化因子(如CXCL8)還可對阿爾茲海默病引起的神經病變具有保護作用[11]。近幾年的研究發現，趨化因子在骨癌痛的發生過程也發揮著重要作用，比如CX3CL1、CXCL10、CXCL13、CCL2和CCL5等趨化因子，通過作用于脊髓內小膠質細胞、星形膠質細胞或神經元表面的趨化因子受體，直接參與骨癌痛的發生過程，趨化因子介導疼痛的過程非常迅速，在動物實驗中，給予趨化因子重組蛋白可在幾分鐘內使動物的痛閾明顯下降[3, 12-14]，本研究中CXCL13重組蛋白可在建模后1 d使骨癌痛大鼠的痛閾下降，加快骨癌痛的形成，說明趨化因子本身就是一個致痛分子。

在骨癌痛模型中，脊髓內星形膠質細胞可發生形態和分子學活化改變，其具體形態包括胞體肥大、突觸增粗和細胞數量增多，其分子層面改變包括IL-1、IL-6和TNF-α等分子的釋放，趨化因子通過結合星形膠質細胞表面的受體，進而啟動細胞內的活化信號通路，釋放炎性因子，作用于神經元，從而促使骨癌痛的形成[15-16]。在本研究中，通過干預CXCL13-CXCR5通路，可對星形膠質細胞的活化、增殖和遷移產生直接作用，說明CXCL13參與骨癌痛的發生可能通過星形膠質細胞活化來完成，但其具體的下游機制仍需進一步研究。綜上所述，趨化因子CXCL13通過激活星形膠質細胞活化參與骨癌痛的發生過程，本研究為骨癌痛的鎮痛治療提供了一個新的治療靶點。