細(xì)胞塊結(jié)合免疫組化技術(shù)在惡性胸腔積液病理診斷中的應(yīng)用

趙 帥，肖 琳

(長沙市第三醫(yī)院病理科，湖南 長沙 410015)

胸腔積液的原因復(fù)雜，常見的原因有結(jié)核、感染、腫瘤等[1-2]。常規(guī)的診斷方法是細(xì)胞學(xué)涂片，但是該方法存在腫瘤細(xì)胞與增生的間皮細(xì)胞不易鑒別的問題，部分病例也會因含血液成分較多而有診斷意義的細(xì)胞量少而難以診斷，并且無法判斷組織來源。本研究采用胸腔積液沉渣做細(xì)胞塊，并應(yīng)用免疫組化等方法進(jìn)行檢測，探討細(xì)胞塊結(jié)合免疫組化技術(shù)在惡性胸腔積液原發(fā)疾病肺癌的病理分型診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2012年1月至2018年6月我院病理科歸檔的確診的惡性胸腔積液的具有常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片和細(xì)胞塊資料的患者50例，其中男29例，女21例；年齡48～80歲，中位年齡64歲；原發(fā)腫瘤肺癌的組織學(xué)分型：腺癌30例，鱗癌12例，小細(xì)胞癌8例。所有病理資料均經(jīng)高年資病理科醫(yī)師復(fù)核。

1.2 細(xì)胞學(xué)涂片將標(biāo)本靜置6～12 h，移去上清液，取50 mL入試管內(nèi)離心，2 000 r·min-1離心5 min后，棄去上清液，將底部約0.5 mL細(xì)胞液混勻，均勻涂于載玻片上，然后體積分?jǐn)?shù)95%乙醇固定10～30 min，然后進(jìn)行HE染色。

1.3 細(xì)胞塊的制作將胸腔積液放入50 mL的離心管中，2 500 r·min-1離心10 min，反復(fù)數(shù)次離心留取底部沉渣部分，移去上清液并加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%中性多聚甲醛固定液離心靜置1 h，然后取沉淀物放入包埋盒內(nèi)常規(guī)脫水包埋，4 μm切片，然后進(jìn)行HE染色。

1.4 免疫組化染色將50例惡性胸腔積液細(xì)胞塊切片進(jìn)行免疫免疫組化分析。本實(shí)驗(yàn)的抗體及DAB顯色試劑均購自廣州深達(dá)生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)采用免疫組化染色方法，操作過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。細(xì)胞蠟塊切4 μm切片，常規(guī)烤片1 h脫蠟至水，過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，微波抗原修復(fù)，加入一抗4 ℃孵育過夜，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，PBS代替一抗作陰性對照。

1.5 結(jié)果判定免疫組化的結(jié)果：癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)、細(xì)胞角蛋白7(Cell Keratin 7，CK7)、天冬氨酸蛋白酶A(NapsinA)、淋巴細(xì)胞抗原(lymphocyte antigen，CD56)、嗜鉻素A(chromogranin A，CgA)、細(xì)胞角蛋白5/6(cytokeratin，CK5/6)陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜出現(xiàn)陽性顆粒，甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1(Thyroid transcription factor,TTF-1)、腎母細(xì)胞瘤基因(Nephroblastoma gene,WT-1)、P63陽性表達(dá)為細(xì)胞核出現(xiàn)陽性顆粒。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示，比較用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

腺癌中CEA陽性表達(dá)率80.00%、CK7為86.66%、NapsinA為90.00%、CD56為0.00%、CgA為10.00%、CK5/6為0.00%、TTF-1為100.00%、WT-1為10.00%、P63為16.66%；鱗癌中CEA陽性表達(dá)率25.00%、CK7為16.66%、NapsinA為0.00%、CD56為0.00%、CgA為16.66%、CK5/6為100.00%、TTF-1為8.33%、WT-1為16.66%、P63為100.00%；小細(xì)胞癌中CEA陽性表達(dá)率25.00%、CK7為12.50%、NapsinA為0.00%、CD56為100.00%、CgA為100.00%、CK5/6為0.00%、TTF-1為87.50%、WT-1為12.50%、P63為0.00%。見表1。

表1 不同組織類型肺癌惡性胸腔積液細(xì)胞塊中各指標(biāo)的表達(dá)

3 討論

很多肺癌患者在未發(fā)現(xiàn)原發(fā)病灶之前主要表現(xiàn)為胸腔積液，如何能夠明確胸腔積液的性質(zhì)，在明確性質(zhì)后如何對肺癌進(jìn)行組織學(xué)分型具有重大意義。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)指南對非小細(xì)胞肺癌的治療方案也根據(jù)病理分型而制定[3]。

本實(shí)驗(yàn)采用的是胸腔積液離心制作細(xì)胞塊的方法，此方法相對于傳統(tǒng)涂片更具有優(yōu)勢。傳統(tǒng)的涂片檢查方法是將標(biāo)本靜置后進(jìn)行直接細(xì)胞學(xué)涂片，查找具有診斷意義的細(xì)胞，但是這種方法送檢標(biāo)本細(xì)胞密度低且混有紅細(xì)胞及炎性滲出物等造成細(xì)胞涂片厚度不均勻，細(xì)胞多層重疊，容易造成惡性腫瘤的漏檢[4]。做成細(xì)胞塊連續(xù)切片能夠較好的保留組織學(xué)結(jié)構(gòu)，如腺管、腺泡、乳頭結(jié)構(gòu)等[5-6]，且細(xì)胞塊為將來的免疫組化及基因檢測提供了較好的組織基礎(chǔ)和可操作性，從本實(shí)驗(yàn)的胸腔積液細(xì)胞塊HE切片中可以看出腺癌很多時(shí)候可以看到腺管狀、乳頭狀結(jié)構(gòu)，鱗癌也可以看到類似組織學(xué)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，小細(xì)胞癌可以看到擠壓變形的腫瘤細(xì)胞，當(dāng)然這種HE切片的形態(tài)學(xué)觀察依然有些主觀，為了更精準(zhǔn)分型，以滿足臨床上制定治療方案的需求，我們在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了免疫組化檢查，采用CEA、CK7、NapsinA、CD56、CgA、CK5/6、TTF-1、WT-1、P63等抗體進(jìn)行檢測并探討其診斷的價(jià)值。結(jié)果顯示，腺癌中陽性率較高的抗體是TTF-1、CK7、NapsinA及CEA，TTF-1是一種相對分子質(zhì)量38 000～40 000的核蛋白，在胎兒肺組織及成人的Ⅱ型肺泡上皮中存在，大多數(shù)肺腺癌、肺小細(xì)胞癌免疫組化顯示TTF-1陽性，而在肺鱗癌中陰性[6]。本研究顯示不同病理類型的肺癌中，腺癌中TTF-1陽性率100.00%，與文獻(xiàn)相符。NapsinA是一種胃酶樣天門冬氨酸蛋白酶，是肺腺癌的一種新標(biāo)志物[7]，本研究結(jié)果顯示，NapsinA陽性率90.00%,而在鱗癌和小細(xì)胞癌中均是陰性，說明其敏感性和特異性均較好，是一種好的腺癌標(biāo)志物。本研究結(jié)果還顯示CK7、CEA在腺癌中的表達(dá)較好，特別是CK7在腺癌中表達(dá)高，鱗癌及小細(xì)胞癌表達(dá)低，也是具有較高的診斷應(yīng)用價(jià)值。鱗癌中陽性率較高的抗體是CK5/6和P63，p63作為鱗癌的標(biāo)記物，敏感性極高且陽性定位于細(xì)胞核，CK5/6陽性定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，本研究結(jié)果顯示p63和CK5/6在鱗癌中陽性率為100.00%，且CK5/6在腺癌和小細(xì)胞中均未見表達(dá)，可見其敏感性和特異性均較高。小細(xì)胞癌中陽性率較高的抗體是CD56和CgA。肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤推薦的免疫組化標(biāo)志物為CgA、CD56和Syn，我們的研究結(jié)果也證實(shí)，在胸腔積液細(xì)胞塊中的腫瘤細(xì)胞做免疫組化，小細(xì)胞癌中陽性率較高的也是CD56和CgA。

總之，通過我們的研究顯示，通過細(xì)胞塊結(jié)合免疫組化的方法可以明顯提高胸腔積液直接涂片法的準(zhǔn)確率，在形態(tài)學(xué)傾向腺癌時(shí)可以選擇TTF-1、CK7、NapsinA及CEA; 傾向鱗癌時(shí)可以選擇P63和CK5/6，傾向小細(xì)胞癌時(shí)可以選擇CD56和CgA。這些抗體在敏感性核和特異性都具有很好的應(yīng)用價(jià)值。而且通過細(xì)胞塊的制作也為基因檢測做了基礎(chǔ)，當(dāng)然其對于基因檢測的應(yīng)用價(jià)值還需要進(jìn)一步檢測。