血清細胞骨架蛋白4檢測對肝細胞癌的診斷價值

朱錦舟，張慧嫻，奚黎婷，許春芳，吳愛榮

（蘇州大學附屬第一醫院 消化內科，江蘇 蘇州 215000）

原發性肝癌是世界第5、我國第3 最易導致患 者死亡的惡性腫瘤，我國每年因肝癌死亡約11 萬人，占全世界肝癌死亡人數50%[1]。根據病理學分類，原發性肝癌大多是肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）[2]。由于其發病早期無明顯癥狀，進展迅速，出現癥狀確診時已達疾病晚期，多發生遠處轉移，預后差。因此，肝癌的早期篩查和監測工作是重中之重[3]。甲胎蛋白（alpha fetoprotein,AFP）是HCC 最常見的血清標志物，但在臨床應用中發現AFP 對于早期肝癌的診斷價值有限，存在一定的假陽性及假陰性[2-3]。細胞骨架蛋白4（cytoskeleton-associated protein,CKAP4）是一種連接于微管和內質網的Ⅱ型跨膜蛋白，近年來的研究發現其功能上與細胞凋亡及胞內蛋白轉運有密切的關系，被認為是腫瘤診斷和治療的潛在靶點[4-5]。本研究旨在探討血清CKAP4 水平檢測對HCC 的臨床診斷意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2013年1月—2017年12月蘇州大學附屬第一醫院HCC 患者88 例為HCC組，同期選取肝硬化患者91 例，慢性乙型肝炎患者87 例，門診體檢部健康體檢者81 例為3 個對照組。3組患者及健康體檢者的性別、年齡差異無統計學意義（P＞0.05）。參與者均知情并簽署知情同意書。

1.2 疾病診斷

1.2.1 HCC 診斷 首先經影像學，如肝臟超聲或腹部CT 檢出，而后參照美國肝病研究學會（AASLD）的標準，經超聲肝穿取組織病理證實HCC[2]。根據巴塞羅那肝癌分級標準（BCLC）[6]，將HCC 患者分期，其中0 期和A 期定義為早期HCC。

1.2.2 慢性乙型肝炎診斷 參照慢性乙型肝炎防治指南（2015年更新版）[7]，慢性乙型肝炎病毒感染需滿足乙肝表面抗原和/或病毒DNA 陽性6 個月以上。

1.2.3 肝硬化診斷 綜合考慮包括臨床表現、實驗室檢查、組織學、影像學及組織病理等依據。根據科技部重大專項課題指南[8]，肝活組織檢查作為金標準，即出現彌漫性肝纖維化伴假小葉形成。

1.2.4 健康體檢者符合條件 ①肝臟生化相關指標無異常；②既往無肝病病史；③無其他系統性疾病或惡性腫瘤。

1.3 實驗室檢測

在疾病診斷和體檢時一并收集患者及健康體檢者清晨空腹血。血樣收集后統一離心并置入-80℃冰箱冷凍保存。血生化檢查采用Hitachi 7600 全自動生物化學分析儀（韓國日立有限公司）。血清CKAP4 水平采用ELISA 試劑盒（No：CSB-EL005453HU，武漢華美生物工程有限司）。血清AFP 檢測采用ELISA 試劑盒（美國Abbott 公司）。實驗步驟按照試劑盒說明書進行操作并重復。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 24.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）及中位數和四分位數M（P25，P75）表示，比較采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis檢驗，符合正態分布的兩組數據采用LSD-t檢驗。受試者操作特征（receiver operating characteristics,ROC）曲線用于評價蛋白對HCC 識別能力，比較ROC 曲線下面積（AUC）、敏感性及特異性。最佳Cut-off 值根據約登指數 方法來確定。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC組患者一般資料

納入研究的88 例HCC 患者一般資料見表1。

表1 HCC 患者一般資料（n =88）

2.2 4組AFP 和CKAP4 水平比較

HCC組血清AFP 水平為143.2（27.9，265.4）ng/ml，健康體檢者血清AFP 水平為7.8（4.6，10.4）ng/ml，慢性乙型肝炎患者血清AFP 水平為30.5（21.1，48.7）ng/ml，肝硬化患者血清AFP 水平為30.9（21.6，51.4）ng/ml。4組比較，差異有統計學意義（F=69.410，P=0.000）。HCC組血清AFP 水平分別與健康體檢組、慢性乙型肝炎組、肝硬化組3 個組比較，差異有統計學意義（t=10.470，7.737 和7.849，均P=0.000），實驗組高于其他3 個對照組。見圖1。

HCC組血清CKAP4水平為345.9（262.7，468.0）pg/ml，健康體檢者血清CKAP4 水平為162.1（96.6，246.5）pg/ml，慢性乙肝患者血清CKAP4 水平為162.0（75.5，266.2）pg/ml，肝硬化患者血清CKAP4 水平為209.5（109.5，292.8）pg/ml。4組比較，差異有統計學意義（F=58.110，P=0.000）。HCC組血清CKAP4 水平分別與健康體檢組、慢性乙型肝炎組、肝硬化組3 個組比較，差異有統計學意義（t=10.620，10.520 和8.616，均P=0.000），HCC組高于其他3 個對照組。見圖1。

2.3 AFP 與CKAP4 對HCC 的診斷價值

根據相關指南，選定20ng/ml 作為AFP 的Cut-off值，AUC 為0.796（95% CI：0.732，0.859），敏感性為0.795，特異性為0.425。根據約登系數原則，CKAP4 的Cut-off值為261.1 pg/ml，AUC 為0.843（95% CI：0.799，0.888），敏感性為0.761，特異性為0.737。兩者間AUC 差異無統計學意義（chi2值=1.33，P=0.248）。見圖2。

2.4 AFP 與CKAP4 對早期HCC 的診斷價值

選擇20 ng/ml作為AFP的Cut-off值，判斷早期HCC 的AUC 為0.725（95% CI：0.638，0.813），敏感性為0.725，特異性為0.425。選擇261.1 pg/ml 作為CKAP4 的Cut-Off 值，判斷早期HCC 的AUC 為0.865（95% CI：0.814，0.915），敏感性為0.784，特異性為0.737。兩者間AUC比較，差異有統計學意義（chi2值=7.03，P=0.008），CKAP4 優于AFP。見圖2。

圖1 各組APF 和CKAP4 的循環濃度（±s）

圖2 以AFP 和CKAP4 繪制診斷HCC 和早期HCC 的ROC 曲線

3 討論

我國是肝病大國，其肝癌占全球發病總數超過一半[9]。由于肝癌早期癥狀隱匿、病程短、進展快，發現時多已進入進展期，或合并遠處轉移，預后極差，5年生存率不足10%[1]。因此，對高危人群進行定期篩查，及早診斷肝癌患者，對其治療和預后尤其關鍵[10]。

目前臨床實踐中，面對疑似HCC 的患者，主要是通過完善影像學檢查，包括超聲和CT，同時檢測血清AFP 水平來探討HCC 診斷可能的[2]。AFP 作為廣泛應用的HCC 篩查和診斷的腫瘤生物標志物，動態觀察其變化情況對早期診斷具有重要的臨床意義[3]。但AFP 在HCC 早期診斷存在2 個問題：其一是敏感性一般，AFP 水平與肝癌腫塊大小相關，腫塊過小時，AFP 常低于參考值，腫塊過大時，AFP 也會出現表達延遲，造成假陰性；其二是特異性差，AFP 不僅在HCC 患者外周血中升高，在慢性肝炎及肝硬化患者中也常有增高，造成假陽性[11]。臨床工作中就需要一種敏感性及特異性較均衡且穩定的新型腫瘤標志物運用于HCC 的早期診斷。

CKAP4 又稱P63，是一種跨膜蛋白，作為細胞的一個受體，近年來被證實其與腫瘤細胞的異常行為特征密切相關。2014年LI 等[12]發現HCC 患者的肝癌組織中CKAP4 表達，與癌旁組織或正常肝組織相比，明顯上調。同時，CKAP4 的表達水平與腫瘤大小、肝內轉移、門脈轉移及HCC 分期相關。此外，CKAP4還與患者整體預后及生存期相關。隨后，LI 等[13]在體外細胞水平及BALB/c 雄性裸鼠在體水平進行試驗證實CKAP4 是通過EGFR/Gab1/AKT 通路參與對HCC進展和轉移的調控。既往研究證實提示CKAP4 蛋白可通過外泌體形式釋放入外周循環中，可在血清和尿液中被檢測到[14-15]。

在本項研究中，首次報道運用ELISA 試劑盒檢測多組慢性肝病患者血清中CKAP4 水平。通過對比和數據分析，本研究發現：與慢性乙型肝炎、肝硬化及健康體檢者比較，HCC 患者血清中CKAP4 水平升高；用于判斷HCC 患者，CKAP4 與AFP 無差異，但其特異性優于AFP，彌補AFP 假陽性高的缺點；用于判斷早期HCC 患者，在保持較高敏感性的同時，CKAP4的準確性和特異性優于AFP。以上發現提示CKAP4可作為臨床實踐中HCC 早期篩查診斷的血清標志物。

本研究是一項回顧性病例對照研究，因此今后多中心前瞻性隊列研究仍需設計并進行，以期進一步明確CKAP4 在HCC 發生、發展中的作用及臨床運用價值。此外，需納入丙型肝炎病毒感染或酒精性肝病的患者，以及其他消化道腫瘤，如胃癌、肝內膽管細胞癌等，以此排除其他原因造成的假陽性現象。