胚胎玻璃化冷凍解凍技術對子代胚胎和胎盤中印記基因H19表達及甲基化水平的影響

馬媛，陳書強，馬夜肥，雷暉，文亮，王曉紅

(中國人民解放軍空軍軍醫大學唐都醫院婦產科生殖醫學中心，西安 710038)

胚胎冷凍解凍技術作為試管嬰兒的必備延伸技術，自其誕生至今發展迅速[1]。人類輔助生殖技術(ART)在控制性促排卵技術(COH)下可獲得多個卵母細胞，IVF后可獲得多枚胚胎，新鮮周期移植后剩余胚胎進行冷凍保存以備后用。胚胎冷凍保存技術的應用及其發展進步，減少了促排卵次數和胚胎的浪費，從而增加了胚胎移植機會[2]。現有研究表明，相比于新鮮胚胎移植，胚胎玻璃化冷凍解凍移植(VET)可以改善多囊卵巢綜合征(PCOS)不孕婦女的活產率[3]，但在卵巢功能正常的婦女中VET并不能增加活產率[4]。且VET可增加多囊卵巢婦女妊娠期高血壓疾病的發生風險[3]。通過VET技術出生的子代平均體重高于新鮮胚胎移植子代，巨大兒的發生率高[5]。因此該技術潛在的風險仍不明確，其安全性及對子代的影響仍然需要深入研究。

表觀遺傳修飾在生命現象中普遍存在，是一種特殊的基因調節方式，包括DNA甲基化、乙酰化、組蛋白修飾和非編碼RNA調節等。在原始生殖細胞中，雙親DNA甲基化模式消除并開始重新建立，在受精及后續的胚胎發育中不斷重建及維持[6]。這個敏感時期表觀遺傳學改變可能導致胚胎甚至成年后的多種疾病[7]。而ART中COH、胚胎體外授精、體外培養以及胚胎冷凍及解凍均是在胚胎表觀遺傳學修飾的關鍵時期進行的，這些操作均有可能影響胚胎的表觀遺傳并對其發育及誕生的子代產生長遠影響[8]。近年來多項研究報道了ART技術助孕的子代出現了表觀遺傳紊亂及疾病[9]，因此ART技術與胚胎早期表觀遺傳改變和子代健康成為了近年研究熱點。

印記基因H19是目前表觀遺傳中研究比較成熟的印記基因之一，其在轉錄水平進行調控，主要參與胚胎的正常生長、胚胎發育及小兒行為發展[10]。有報道發現，H19的異常甲基化狀態可導致Beckwith-Wiedemann綜合征(BWS)[11]。而銀羅素綜合征(SRS)患者中也發現了H19的異常低甲基化狀態[12]。因此評估胚胎玻璃化冷凍是否會導致H19的表達紊亂十分重要。本研究通過建立VET的小鼠模型，收集孕9.5 d胎鼠和胎盤標本，此時期小鼠的胚胎和胎盤剛剛分化，其胎盤功能剛剛建立，相當于人類妊娠中的早期，由于胎盤早期的功能對后期胚胎及胎盤的發育至關重要，所以我們先選擇了這個時間節點進行檢測和分析，分析該時期胎鼠和胎盤的H19表達及甲基化狀態，有助于我們探索H19對胎鼠和胎盤的不同影響及胎盤早期功能的研究分析。

材料與方法

一、實驗材料

1. 實驗動物：小鼠品系為ICR清潔級小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。雌鼠4～6周齡，雄鼠3～6月齡。

2. 主要試劑和儀器：胚胎冷凍解凍液體及栽桿購自日本Kitazato公司，胚胎培養采用KSOM胚胎培養液(Millipore，美國)，RNA提取采用TRIzol?Reagent(Invitrogen，美國)，反轉錄試劑盒和熒光聚合酶鏈反應試劑盒購自日本Takara公司，DNA提取采用DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen，德國)，亞硫酸氫鈉修飾采用EZ DNA Methylation-GoldTM KitD5005(北京天漠)，實體解剖鏡(北京Motic)，CO2培養箱(Thermo，美國)，培養皿(35 mm)(Nunc，丹麥)，超凈臺(Labconco，美國)，ND2000分光光度儀(Thermo，美國)，熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)。

二、研究方法

1.實驗分組：將雌性小鼠根據處理方式的不同分為3組，分別是：自然交配組(NC)組，體外培養組(IVC)組，凍胚移植組(VET)組。每組各收集7只孕鼠。NC組：分撿發情雌鼠，與雄鼠自然合籠，次日檢查陰栓，見陰栓者即為交配成功，當日記作E0.5 d。IVC組：分撿發情雌鼠，與雄鼠自然合籠，次日檢查陰栓，見陰栓者當日處死雌鼠，于輸卵管取受精卵，用0.3%透明質酸酶消化，然后將消化分離的受精卵多次沖洗，轉入KSOM溶液中培養至囊胚后進行胚胎移植。VET組：在IVC組基礎上，受精卵培養至8細胞時，進行胚胎的玻璃化冷凍及復蘇，復蘇后轉入KSOM溶液中培養至囊胚后進行胚胎移植。

2. 胚胎玻璃化冷凍及解凍：(1)胚胎冷凍：將胚胎從培養液中轉移至平衡液ES中，室溫下靜置5 min。隨后，轉入玻璃化冷凍液VS中，60 s以內將胚胎轉移至做好標記的載桿上，迅速投入液氮中并蓋帽保存。(2)胚胎解凍：從液氮中取出栽桿，迅速將裝有胚胎的葉片前端浸入TS液中，1 min內將胚胎轉移至DS中，3 min后將胚胎轉移至WS1中，作用5 min，最后將胚胎移入WS2中，并將培養皿移至37℃熱板上加熱5 min后，轉移至胚胎培養液中。

3. 胚胎移植及標本收集：小鼠胚胎移植方法參照我科既往研究[13]，每只代孕鼠左右側宮腔各移植入8枚胚胎，共計16枚胚胎，移植當日計為E3.5 d。在3組小鼠E9.5 d脫頸處死孕鼠，計算活胎率(形態正常的胎鼠即活胎)。并收集胎鼠及胎盤組織，單個存放，投入液氮備用。

4. 實時定量PCR檢測H19的表達：(1)總RNA提取：分別取3只孕鼠的6個胎鼠及胎盤組織按照試劑說明進行總RNA提取。檢測總RNA質量，行后續實驗；(2)cDNA合成：按照試劑說明進行cDNA合成。吸取1 μl/2 μl(1 μg/μl)總RNA為模板，反轉錄合成cDNA；(3)實時定量PCR：根據TaKaRa實時定量PCR試劑盒說明書配制反應體系，反應總體系為20 μl：SYBR Green 10 μl，PCR特異上、下游引物按1∶1混合后取1.5 μl，cDNA模板1.5 μl，滅菌蒸餾水7 μl。擴增條件：95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個cycle；72℃ 2 min。以GAPDH為內參，進行PCR反應，引物序列來自Primerbank。H19引物序列：上游引物5’-CTTGTCGTAGAAGCCGTCTGTTC-3’，下游引物5’-GTAGCACCATTTCTTTCATCTTGAGG-3’；GAPDH引物序列：上游引物5’-TGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3’，下游引物5’-AGAGTGGGAGTTGCTGTTGAAG-3’。每次檢測設定3個復孔，每個樣本重復3次。在每個PCR循環的延伸期采集熒光信號，PCR反應完成后利用溫度梯度變性獲得溶解曲線供PCR產物定性分析。根據PCR擴增曲線，得到每個樣本的循環周期數(Cq值)，使用 2-△△Ct法計算各組中目的基因的表達水平情況。

5. 焦磷酸測序檢測H19基因的甲基化水平：(1)引物設計：使用Primer Premier 5進行引物設計，共檢測2個片段，6個CpG位點，H19第一片段序列：上游引物5’-TGAGTTAGGGTTGGAGAGGAA-3’，下游引物5’-CCCAACAACTCCCCTTTATC-3’；H19第二個片段序列：上游引物5’-TTTGGAGTTTGGTAGGAATGTT-3’，下游引物5’-CCCAACAACTCCCCTTTATC-3’；(2)DNA提取及亞硫酸氫鈉修飾：按照試劑盒說明書提取單個胚胎及胎盤中的DNA樣品，每組取胚胎及胎盤各8個。提取后采用ND2000分光光度計測定DNA濃度以及A260/A280，比例在1.9～2.1之間說明DNA純度較好，標本符合測定標準后進行后續操作。亞硫酸氫鈉修飾按照試劑盒進行。(3)焦磷酸測序：采用測序技術對亞硫酸氫鹽處理后的基因組DNA樣品進行PCR產物分析，以定量位點特異性甲基化水平，該實驗部分由上海生工生物工程有限公司完成，使用PyroMarkCpG software 1.0.11進行測序和分析。

三、統計學分析

結 果

一、3組孕鼠妊娠結局比較

3組孕鼠各7只，IVC和VET組中每只代孕鼠移植胚胎16枚，各組共移植112枚胚胎。NC組的平均窩仔數(10.43±2.07)顯著高于IVC組的(6.43±1.51)和VET組的(6.00±1.16)(P<0.05)。比較3組孕鼠在孕9.5 d時的存活率，結果顯示，IVC組和VET組的存活率分別為40.2%和37.5%，與NC組(100.0%)比較均顯著性下降，差異具有統計學意義(P<0.05)。IVC組與VET組兩組的存活率比較無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 三組孕鼠妊娠結局比較[(-±s)，%]

注：與NC組比較，*P<0.05

二、3組孕9.5 d胚胎和胎盤組織中H19基因表達水平比較

對比3組孕9.5 d的胚胎及胎盤中H19基因表達水平，結果顯示：在胚胎組織中，IVC組和VET組的H19表達水平顯著高于NC組(P<0.05)，而IVC組和VET組間比較無顯著性差異(P>0.05)；在胎盤組織中，3組間H19表達水平比較無顯著性差異(P>0.05)(表2，圖1)。

表2 三組孕9.5 d胚胎及胎盤組織中H19基因表達水平比較(-±s)

注：與NC組比較，*P<0.05

注：與NC組比較，*P<0.05圖1 三組孕9.5 d的胚胎及胎盤組織中H19基因表達水平

三、3組H19基因甲基化水平的比較

檢測3組孕9.5 d的胚胎和胎盤組織中H19基因的甲基化水平，結果顯示：在胚胎和胎盤組織中，3組間H19基因甲基化水平比較均無顯著性差異(P>0.05)。對每一個CpG位點進行分析結果顯示，3組H19基因甲基化水平比較均無顯著性差異(P>0.05)(表3，圖2、3)。

表3 三組孕9.5 d胚胎及胎盤組織中H19基因甲基化水平比較(-±s)

A：3組胚胎組織中H19基因總體甲基化水平；B：3組胎盤組織中H19基因總體甲基化水平；C：3組胚胎組織中H19基因每個CpG位點分析；D：3組胎盤組織中H19基因每個CpG位點分析圖2 三組孕9.5 d的胚胎及胎盤中H19基因甲基化水平分析

A：3組胚胎組織中H19基因總體甲基化水平；B：3組胎盤組織中H19基因總體甲基化水平圖3 三組孕9.5 d胚胎及胎盤組織中H19基因甲基化水平檢測示例

討 論

早期胚胎所處環境對其影響巨大，并對后期甚至子代產生長時程影響[6]。印記基因H19是最早被發現的父源印記、母源表達的印記基因。在胚胎生長過程中，父源印記的基因傾向于保護母體，會適當抑制胚胎在子宮內的生長和發育，該印記基因的表達異常不僅可以直接對胚胎發育產生影響，而且可以通過影響胎盤的尺寸和營養代謝從而對胚胎的發育造成間接影響[10，14]。在胚胎印記重新編程的過程中，玻璃化冷凍是一種醫源性應激，可造成多種表觀遺傳紊亂。研究發現，玻璃化冷凍解凍的小鼠卵母細胞和牛卵母細胞均出現了印記基因紊亂，并且經過玻璃化冷凍解凍的卵母細胞受精后，其形成的囊胚中發現了選擇性甲基化缺失，導致印記基因表達異常[15-16]。對于2-細胞期、8-細胞期到囊胚期小鼠胚胎進行玻璃化冷凍解凍，均可降低胚胎整體DNA甲基化水平[17]。在通過凍融胚胎移植(FET)技術輔助受孕出生的新生兒胎盤中，有報道發現出現印跡基因表達異常，而這些印記基因可能與基因表達、胚胎生長發育、細胞遷移和Ⅱ型糖尿病(T2DM)的調控有關[18]。以上證據均證明，玻璃化冷凍解凍過程可能影響胚胎的表觀基因組。所以需要更多的研究來了解該技術對表觀遺傳的影響。

本研究通過建立胚胎玻璃化冷凍解凍的小鼠模型，探索了玻璃化冷凍技術對小鼠胎盤建立早期(孕9.5 d)時胎鼠和胎盤組織中H19的表達和甲基化水平的影響。本研究發現，在孕9.5 d，IVC組及VET組的存活率顯著低于NC組小鼠；在胚胎組織中，H19基因表達水平在IVC組及VET組顯著高于NC組，但是在胎盤組織中并未發現H19在3組間表達的顯著差異。進一步對胚胎和胎盤組織中H19基因的甲基化水平進行焦磷酸測序，結果并未發現H19的甲基化水平受到影響。

既往研究中發現，8細胞期小鼠胚胎進行玻璃化冷凍之后培養至囊胚，出現了H19表達水平的下降，而這一調控與組蛋白修飾有關[19]。但在人類第3天卵裂期胚胎經過玻璃化冷凍后，對發育至囊胚期的胚胎進行檢測，其中分析了18個CpG位點，并未發現玻璃化冷凍對其產生影響[20]。2010年Wang等[21]建立小鼠模型，將玻璃化冷凍解凍后的胚胎移植入假孕受體，結果顯示，相比自然妊娠小鼠，玻璃化冷凍可導致E14.5的胚胎中H19基因的表達顯著增加，本研究結果與之相似，表明玻璃化冷凍組中H19基因在胎盤建立早期就已經在胚胎中出現高表達的現象；但是在E14.5的胎盤組織中，該研究發現玻璃化冷凍組出現H19表達的差異性下調，而本研究3組胎盤組織中未發現H19基因的變化。分析原因，該研究中玻璃化冷凍的胚胎是經過超促排卵、體外授精獲得的，而本研究中未進行超促排卵，并且均為體內受精，既往研究中超促排卵和體外授精均可導致印記基因的紊亂，故該原因可能成為潛在的影響因素。另外，我科既往研究對自然妊娠、體外培養和體外授精的3組小鼠孕14.5 d和孕18.5 d的胎盤H19基因表達進行了研究，發現在孕14.5 d胎盤中H19基因的表達上調，而在孕18.5 d H19基因的表達下降[22]，該研究結果也提示我們H19基因在小鼠孕期的表達呈波動性，在孕9.5 d的胎盤組織我們雖然未發現H19的表達差異，但后續結果如何仍需要進一步研究探索。

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要方法之一，主要修飾位點發生在DNA的CpG島上。本研究中對H19基因的甲基化水平進行了分析，3組間未發現差異。既往研究中對H19的差異性甲基化區(DMD)的甲基化表達水平進行了分析，結果顯示胚胎中H19DMD區發生了甲基化的丟失[21，23]，故該研究認為是H19DMD區域的甲基化丟失導致了H19表達水平的升高。結合既往研究，我們認為經過玻璃化冷凍解凍后，胚胎發育的不同階段，H19表達水平均處于變化中，這些變化均與表觀遺傳修飾直接相關。當然，后續對H19DMD區的甲基化水平檢測以及其他修飾方式如組蛋白修飾等也是我們下一個研究的重點。

由以上結果看出，胚胎的玻璃化冷凍解凍及胚胎的體外培養均可導致小鼠存活率下降，胚胎組織中H19基因的水平增高。但并未發現胎盤組織中H19基因水平的變化，且無論是胚胎組織或胎盤組織中，H19基因甲基化水平均未發現變化，后期需要更多的研究加以探索。