MALBAC-NGS和array CGH檢測染色體異常囊胚的結果比較

王林玉，施文韜，趙正豪，柏海燕，師娟子*

(1.西北婦女兒童醫院轉化醫學中心，西安 710061；2.寧夏藥品檢驗研究院，銀川 750004；3.西北婦女兒童醫院輔助生殖中心，西安 710003)

在自然生殖發育過程中，細胞分裂時期染色體不分離或染色單體提早分離和染色體丟失是引起染色體異常的主要原因。染色體異常分為數量異常和結構異常，數量異常更為常見[1]。目前在胚胎種植前篩查的主要技術手段就是胚胎植入前遺傳學篩查或診斷(PGS/PGD)，是在胚胎植入著床之前，對早期胚胎進行染色體數目和結構異常的檢測，分析胚胎非整倍體風險的一種早期產前篩查方法，從而挑選正常的胚胎植入子宮，以期獲得正常的妊娠，提高妊娠率，降低流產率，預防出生缺陷[2-3]。PGS的有效性依賴于早期胚胎活檢技術和遺傳學檢測分析技術。在遺傳學檢測分析技術方面，比較基因組雜交微陣列芯片(array CGH)是第一項廣泛應用于PGS的可進行全部24條染色體篩查的技術，并已成為該領域的金標準。然而，隨著科學的發展和進步，遺傳學檢測技術也不斷推陳出新，二代測序技術(NGS)作為一項新興的遺傳學檢測技術，在輔助生殖醫學領域，尤其是在PGS中的應用價值備受關注[4]。檢測方法的有效性對于PGS的應用前景以及臨床結局至關重要。但是關于兩種檢測方法在PGS中的差異卻鮮有報道。因此，本文擬從我院PGS病例中研究array CGH與多次退火環狀循環擴增-二代測序(MALBAC-NGS)兩種檢測方法的差異，以期為PGS提供一個可靠的檢測手段。

資料與方法

一、研究對象

收集2015年1月1日至2017年4月30日西北婦女兒童醫院生殖中心行PGS的常規IVF-ET患者，以array-CGH法檢測染色體異常的胚胎為研究對象，共收集32枚染色體異常的囊胚同時進行MALBAC-NGS法檢測。PGS檢測在西北婦女兒童醫院醫學遺傳中心完成，采用array-CGH(BlueGnome 24SureV3軟件)檢測。所有進入臨床PGS周期的患者均簽署知情同意書。

二、研究方法

1.囊胚活檢：確認array CGH檢測染色體異常的囊胚，玻璃化解凍復蘇，放入Vitrolife G2.5培養液培養(20 μl)。培養12～24 h后，內細胞團形態明顯者，再次活檢內細胞團和外胚層。內細胞團活檢操作技術難度較高，肉眼觀察內細胞團不少于2/3被活檢視為內細胞團活檢成功，內細胞團活檢失敗或內細胞形態不明顯時，整個囊胚活檢。活檢的細胞組織培養液洗滌后放入裝有5 μl細胞裂解液的PCR管內，離心后-40℃凍存待檢。

2. array CGH法檢測：采用SurePlex DNA Amplification System試劑盒(購自美國New England Biolabs公司)進行全基因組擴增，然后通過array CGH方法(BlueGnome 24SureV3 package kit)對擴增后的產物進行檢測，BlueFuse Multi軟件分析并出具報告。

3.MALBAC-NGS法檢測：采用MALBAC方法將待測樣本進行全基因組擴增，向待測樣本和對照品的PCR管中分別加入裂解酶，放入設定好參數的PCR儀中，裂解細胞，隨后經過預擴增將微量初始模板進行線性擴增，最后經過指數擴增即完成文庫構建。將構建好的文庫純化后定量，隨后測序文庫與引物、dNTPs、DNA聚合酶、引物載體構建“油包水”PCR反應單元后在DA8600測序平臺完成NGS測序工作。檢測內容為染色體非整倍體和10 M以上的片段缺失和/或重復。

三、統計學分析

實驗數據以率(%)進行統計學描述，所有數據采用SPSS 23.0進行統計學分析。

結 果

一、基本數據

共活檢32枚囊胚，均是經array CGH法檢測為異常的囊胚，復蘇培養后再次活檢，通過MALBAC-NGS的方法檢測胚胎染色體，MALBAC-NGS法共檢測到異常囊胚17枚。兩種檢測方法均顯示單個胚胎中一條染色體異常發生率最高(分別為43.75%、58.82%)，3條及以上染色體發生率較低(18.75%、0%)(表1、2)。在染色體缺失及重復異常中，經array CGH方法檢測，9號(21.88%)、16號(21.88%)、22號(21.88%)、10號(18.75%)、13號(18.75%)及15號(18.75%)染色體發生率較高；MALBAC-NGS方法檢測，13號染色體發生率最高(35.29%)(表1、3)。

表1 array CGH法和MALBAC-NGS法檢測32枚胚胎檢測結果展示

續表

表2 array CGH和MALBAC-NGS方法檢測單個胚胎異常染色體數目的發生頻率[n(%)]

表3 array CGH和MALBAC-NGS方法檢測各染色體缺失/重復的發生頻率[n(%)]

二、MALBAC-NGS法檢測內細胞團與外胚層檢測結果比較

內細胞團與外胚層分別活檢的有16枚，用MALBAC-NGS法檢測，其中有14枚胚胎內細胞團和外胚層檢測結果完全一致，一致率達87.5%(14/16)；而另外2枚(7號、12號)胚胎內細胞團和外胚層檢測結果不一致，不一致率為12.5%(2/16)(表1)。

三、兩種檢測方法一致性比較

經array CGH法檢測為異常的胚胎，再用MALBAC-NGS法檢測，其中3號、8號、9號、10號、11號、13號及14號共7枚胚胎檢測結果與array CGH法檢測結果完全一致，一致率達21.88%(7/32)。

四、兩種檢測方法檢測結果比較

32枚胚胎均是經array CGH法檢測異常的胚胎，活檢后再用MALBAC-NGS法檢測，其中15枚胚胎檢測結果為正常(46，XN)，假陽性率達46.88%(15/32)(表1)。

五、兩種檢測方法檢出嵌合率的比較

array CGH法未檢出染色體嵌合的胚胎，而MALBAC-NGS法檢出7號、12號及22號共3枚染色體嵌合的胚胎，染色體嵌合胚胎檢出率9.38%(3/32)，染色體非嵌合胚胎檢出率90.63%(29/32)。

討 論

隨著現代分子生物學的發展，運用于PGS的遺傳學分析技術也在不斷更新，由最初的 PCR僅能檢測單位點的突變，發展到FISH技術，可以檢測少數染色體，后來又出現array CGH技術，可以檢測所有染色體的數目及結構異常，到目前新興的NGS技術，可同時進行染色體異常及單基因疾病的診斷[5]。

本研究中使用MALBAC-NGS方法檢測內細胞團與外胚層，兩者檢測結果完全一致的有14枚胚胎，一致率高達87.5%。這提示我們MALBAC-NGS方法在PGS診斷方面具有較高的可靠性和準確性。因為MALBAC-NGS從基因組擴增就采用高擴增效率、高覆蓋率和均衡性、較低等位基因脫扣率的MALBAC擴增技術[6-7]，且NGS可以對全基因組進行全面地讀取，隨著DNA測序技術的不斷成熟，其數據輸出量不斷增大，因此對異常的發現能力和尋找新信息的能力也不斷增強。

本研究共檢測32枚胚胎，均是array CGH檢測異常的胚胎，活檢后再用MALBAC-NGS檢測，其中有7枚胚胎檢測結果完全一致，另外還有5枚胚胎檢測出其他異常。這提示我們MALBAC-NGS與array CGH技術有較好的一致性。有多個研究驗證了NGS檢測染色體非整倍體的效能。Fiorentino等[8]首次將array CGH作為參照，驗證將NGS用于胚胎非整倍體檢測的精確性。該研究證實了NGS是一項高通量、高度自動化的可用于染色體非整倍體篩查的技術。Yang等[9]也進行了類似試驗，運用NGS技術對從38個PGS周期中獲得的164例全基因組擴增產物(WGA)進行染色體非整倍體篩查，再將檢測結果與之前已有的array CGH 結果進行比較。結果發現，NGS可以精確檢測出所有類型的染色體非整倍體。此外，很多研究也表明MALBAC-NGS與array CGH方法具有高度的一致性[10-11]。

另外，MALBAC-NGS檢出3枚染色體嵌合的胚胎，而array CGH未檢測出嵌合胚胎。array CGH技術無法識別單個堿基，此外，由于分辨率不足，細胞凋亡DNA降解等原因，array CGH無法檢測出小片段的染色體異常，也無法檢出嵌合體胚胎。而NGS的動態范圍較array CGH更加寬泛，染色體拷貝數的變化可在正常背景中清晰可見，較array CGH而言，嵌合體在NGS中也更容易識別。且大量的實驗數據證明，胚胎嵌合體的存在依然使部分具有發育潛能的胚胎被排除[12-13]。因此MALBAC-NGS技術在檢出嵌合率方面優于array CGH。

總之，MALBAC-NGS作為一項高通量、高度自動化的可用于染色體非整倍體篩查的技術，在診斷速度和效率、精確度、動態范圍、分辨率等方面都表現出不凡的優勢。因此，NGS或許可成為一種非常有價值的遺傳檢測分析技術，用來替代當前可用的其他染色體非整倍體篩查技術[14-15]，以期提高胚胎染色體異常的診斷效率。