子宮內膜異位癥患者自然周期卵泡液中細胞因子研究

吳庚香，Nick Bersinger，Michael Mueller，Michael von Wolff

(1. 武漢大學人民醫院生殖醫學中心，湖北省輔助生殖與胚胎發育醫學臨床研究中心，武漢 430060；2.瑞士伯爾尼大學婦女醫院婦科內分泌與生殖醫學科，伯爾尼 3010)

子宮內膜異位癥(endometriosis，EMs)是婦科的常見病，發病率約為5%～10%，是導致患者不孕的原因之一，但其引起不孕的機制至今尚未完全闡明。目前認為異位的內膜組織使機體發生自身免疫應答異常，引起包括盆腔和卵巢局部在內的廣泛炎癥反應[1]。EMs合并不孕患者卵巢儲備功能下降，卵母細胞和胚胎質量下降，影響IVF臨床結局[2]。本研究通過觀察EMs患者自然周期卵泡液中細胞因子的成分變化，探討EMs患者生育力低下的原因。

資料與方法

一、研究對象

募集2013～2016年間在瑞士伯爾尼大學婦女醫院生殖中心因EMs行自然周期IVF-ET或卵胞漿內單精子注射(ICSI)助孕治療的17例患者為研究對象(EMs組)，年齡26～42歲，平均年齡(35.7±3.7)歲。根據美國生殖醫學會EMs分類修訂版對患者內異癥程度進行分期，I～Ⅱ期為輕度EMs組，共7例；Ⅲ～Ⅳ期為中重度EMs組，共10例。同時募集同期17例年齡匹配、因輸卵管因素或男方因素在該中心行自然周期IVF/ICSI-ET助孕的患者做為對照組。所有患者3個月內均無感染性疾病及服用藥物史。本研究得到了醫院倫理委員會的批準，每位患者均簽署了知情同意書。

二、標本收集

所有患者均采用自然周期移植，通過陰道B超及血清LH和E2濃度監測卵泡生長。當卵泡直徑達到18 mm且血清E2濃度達到800 pmol/L時，當晚給予5 000 IU人絨毛膜促性腺激素(HCG，Pregnyl?，MSD，瑞士)肌肉注射，36 h后經陰道取卵。取卵時收集卵泡液，600g離心10 min，再以1 300g離心10 min，收集上清液，儲存于-70℃待檢測。

三、細胞因子檢測

白細胞介素(Interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-15、IL-18，調節活化正常T細胞表達與分泌的趨化因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted，RANTES)，腫瘤壞死因子(TNF)-α，血管內皮生長因子(VEGF)，白血病抑制因子(LIF)等9種細胞因子使用定制的9因子試劑盒(Bio-Rad Laboratories，USA)，在Bio-Plex?平臺按照試劑說明書進行檢測(Bio-Rad Laboratories，USA)，卵泡液使用試劑盒中的樣品稀釋液按1∶3的比例進行稀釋。以Bio-Plex管理軟件6.1版進行原始數據轉換、分析和標準曲線的計算。單核細胞趨化因子-1(monocyte chemotactic factor-1，MCP-1)和瘦素(Leptin)使用R&D Systems(Abingdon，英國)的Duo-Set微孔板ELISA法檢測，使用含1%(w/v) 牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液分別以1∶2和1∶50的比例進行稀釋。

四、統計學分析

采用SPSS 13.0軟件進行數據的處理和統計分析，計量資料采用中位數及范圍值表示，組間比較采用配對Wilcoxon檢驗，各細胞因子間相互關系采用Spearman相關性分析，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、卵泡液中細胞因子濃度

IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、Leptin、VEGF、MCP-1和LIF在所有患者的卵泡液標本中均可檢出，而IL-15、RANTES和TNF-α僅分別能在極少部分患者的卵泡液中檢出[分別為5.9%(2/34)，8.8%(3/34)和5.9%(2/34)]。其中IL-1β和IL-6在EMs患者卵泡液中的濃度顯著高于對照組(中位數比較分別為0.8 pg/ml vs. 0 pg/ml和9.1 pg/ml vs. 6.1 pg/ml)，差異具有統計學意義(P<0.05)，而其他幾種細胞因子濃度在兩組間比較無統計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 采卵日卵泡液中細胞因子濃度[中位數(最小值～最大值)]

注：與對照組比較，*P<0.05

二、不同分期的EMs患者卵泡液中細胞因子濃度比較

通過對輕度及中重度EMs患者卵泡液中細胞因子濃度的比較發現，中重度EMs患者卵泡液中IL-1β濃度(1.44 pg/ml)顯著高于輕度EMs及對照組(分別為0.26 pg/ml、0 pg/ml)，VEGF濃度(2 464 pg/ml)亦顯著高于輕度EMs及對照組(分別為1 268 pg/ml、1 560 pg/ml)，差異具有統計學意義(P<0.05)；而IL-6、IL-8、IL-18、Leptin、MCP-1和LIF等幾種細胞因子濃度在各組間無顯著性差異(P>0.05)(圖1)。

三、卵泡液中細胞因子濃度與EMs分期相關性關系

通過Spearman相關分析發現卵泡液中只有IL-1β和IL-6的濃度與EMs分期相關，大部分細胞因子濃度相互之間存在較強的相關性，且均為正相關，尤其是VEGF與MCP-1兩種細胞因子，與所檢測的其他細胞因子基本都相關；而Leptin則相反，除與VEGF相關外，與所檢測的其他細胞因子均不相關(表2)。

注：與輕度EMs和對照組比較，*P<0.05圖1 不同EMs分期患者卵泡液中細胞因子的表達水平

表2 EMs與卵泡液中細胞因子濃度的Spearman相關性分析(r)

注：*P<0.05，**P<0.01

討 論

EMs被認為是一種慢性進行性炎癥疾病，有研究報道在EMs患者的腹腔液和血液中某些細胞因子水平增高，如IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1、VEGF等[3-6]。而卵泡液是由卵巢的顆粒細胞分泌及血液擴散而來，因此EMs疾病狀態下卵泡液中的細胞因子微環境可能也會受到影響。而卵泡的生長發育、排卵以及黃體形成等過程均涉及多個細胞因子的調節[7]。卵泡液中含有多種生物活性分子和蛋白，構成排卵前卵泡生長和發育的微環境，因此卵泡液中細胞因子的改變必然會導致卵母細胞生長的微環境發生改變，進而直接影響卵母細胞完成減數分裂和受精的能力以及形成胚胎的能力[8]。EMs患者體內異常的細胞因子可能通過影響上述多個環節而導致其生殖功能障礙，導致EMs患者不孕癥發生率增高、IVF妊娠結局較差。然而，既往關于EMs卵泡液的研究結果基本上都來自于常規IVF周期即超促排卵周期，在外源性促性腺激素刺激下，卵泡的激素微環境及血清中的免疫系統都會受到相應的影響[9-10]。因此這種條件下獲得的卵泡液不能反映EMs疾病狀態下卵泡液中真實的細胞因子變化。本研究收集的是自然周期IVF患者采卵日的卵泡液，只在扳機日使用了外源性的HCG，卵泡液受藥物的影響程度已降至最低，基本可完全反映卵泡液在生理狀態下的真實狀態，因此自然周期IVF被認為是研究卵泡液微環境最理想的模型[9，11]。

本研究發現IL-1β和IL-6的水平在EMs患者的卵泡液中顯著高于對照組(P<0.05)，且其濃度與EMs分期顯著相關。IL-1β是一種可通過多種方式促進EMs發展的多效細胞因子，在EMs的形成和進展中具有重要作用[12]。EMs患者腹腔液中IL-1β濃度明顯高于正常對照組[13]，深部浸潤型EMs患者血清中IL-1β濃度也明顯高于淺表型EMs患者及正常對照組，提示IL-1β的異常可能可以影響EMs的病理生理。Pellicer等[3]發現EMs患者的卵泡液中IL-1β濃度高于正常對照組，本研究結果與其一致，但Pellicer的結果尚無統計學意義，這可能與其樣本量太小有關。IL-1β對IVF妊娠結局的影響目前還存在爭議，Asimakopoulos 等[14]發現IVF周期中妊娠的患者其血清中IL-1β的濃度低于未妊娠者，但卵泡液中的IL-1β濃度卻高于未妊娠者。而Zollner等[15]報道卵泡液中高濃度的IL-1β與更高的受精率相關。因此，EMs患者卵泡液中IL-1β的作用還需進一步大樣本的研究探討。

IL-6被認為是一種對卵丘細胞功能、卵冠丘復合物的擴張及卵母細胞功能具有自分泌調節功能的細胞因子[16]。有證據顯示IL-6還可以直接影響卵巢功能，并對生育功能具有重要調節作用。卵泡液中IL-6水平的增高可能影響卵母細胞質量，并且可以降低卵泡中芳香化酶的活性，導致卵泡液中雌激素水平下降，進而導致生育力下降。寧艷春[17]發現EMs患者卵巢卵泡液中IL-6等細胞因子表達升高，認為這些細胞因子制造了卵母細胞生長發育的炎性微環境，使卵母細胞周圍的卵丘顆粒細胞生長發育情況變差，凋亡增多，分泌雌激素的功能受到影響，且體外實驗發現炎性卵泡液培養微環境可降低體外未成熟卵母細胞的成熟率。Pellicer等[3]也發現EMs患者卵泡液和血清中IL-6濃度均高于正常對照組，本研究結果與其一致。

VEGF被認為是誘導血管生成的最重要、最關鍵的因子，在血管形成中起中心調節作用，是EMs發展的關鍵因子，參與EMs患者異位內膜生長并導致患者不孕。研究發現EMs組患者血清和卵泡液中VEGF水平均顯著高于對照組(P<0.001)[18]，且EMs患者血清VEGF水平與EMs分期呈正相關(P<0.001)[19]。在本研究中，EMs組卵泡液中VEGF水平并未明顯高于對照組，但中重度EMs患者其卵泡液中VEGF濃度顯著高于輕度EMs及對照組(P<0.05)，提示VEGF的濃度與EMs嚴重程度相關。MCP-1是一種對單核細胞具有特異性趨化和激活活性的細胞因子，參與EMs的發生和發展。研究發現MCP-1對VEGF表達有正相調節作用，能夠誘導機體內皮細胞遷移，使其參與血管生成這一生理活動，促進EMs的病理進程[20]。本研究通過細胞因子的相關性分析，發現在卵泡液中VEGF與MCP-1的濃度亦成正相關性。EMs的發病機制涉及復雜的細胞因子網絡，這些細胞因子相互作用、相互影響，并參與多個細胞通路，因此彼此的變化都是密切相關的[21]。

綜上所述，不論是超促排卵周期還是自然周期，EMs患者卵泡液中細胞因子微環境都發生了變化，IL-1β和IL-6的濃度均明顯高于對照組，可能與EMs患者生育力降低有關。