宮頸鱗癌組織中HPV感染型別分布情況的分析

陳 曄，顧 蕓，耿建祥，楊開選，路喜安，楊邦杰，武海燕，印永祥，趙 雪

(1.東南大學附屬中大醫院無錫分院婦產科，江蘇無錫 214001；2.南京醫科大學附屬婦產醫院病理科，江蘇南京 210004；3.南京中醫藥大學附屬南京中醫院病理科/海峽兩岸精準醫學協會HPV感染疾病專業委員會，江蘇南京 210001)

宮頸癌是女性生殖器官最常見的惡性腫瘤，是全球婦女惡性腫瘤中僅次于乳腺癌的第二位常見的惡性腫瘤。超過80%宮頸癌患者發生在發展中國家，是發展中國家婦女最主要的腫瘤類型。該腫瘤有明確的病因學，即高危型人乳頭瘤病毒(HPV)持續感染所致。在全世界范圍內，宮頸癌發病率有明顯的地區差異性。我國宮頸癌每年新發病例約13萬人，每年死亡人數約5萬人。近十年來，我國宮頸癌的發病率仍居高不下，且呈現出年輕化的趨勢，因此，我國宮頸癌的預防與治療越來越受到人們的重視。宮頸癌有許多亞型，其中最主要的類型是宮頸鱗狀細胞癌，簡稱為宮頸鱗癌，約占宮頸癌的85%[1-4]。國內文獻檢索未見宮頸鱗癌組織HPV分型檢測的大樣本研究資料。本研究旨在探討以江蘇省為主的區域性宮頸鱗癌組織中HPV感染基因型分布狀況及疫苗保護的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集1978年11月至2018年9月江蘇省無錫市錫山人民醫院、安徽省安慶市第一人民醫院和第二人民醫院、安徽省當涂縣人民醫院、浙江省寧波市鄞州人民醫院、山東省臨沂市腫瘤醫院、河南省商城縣人民醫院、江蘇省南京市婦幼保健院、南京市六合區人民醫院和六合區中醫院、南京市大廠醫院、南京市中醫院、上海梅山醫院、鎮江市第一人民醫院、鎮江市丹徒區人民醫院、楊中市人民醫院、徐州市中醫院、徐州市婦幼保健院、新沂市人民醫院、邳州市人民醫院、射陽縣人民醫院、大豐市人民醫院、常熟市第一人民醫院、常熟市中醫院、金湖縣人民醫院、靖江市人民醫院、鹽城市第一人民醫院、興化市人民醫院、昆山市第一人民醫院、揚州市洪泉醫院、江蘇大學附屬醫院病理科病理組織學診斷為宮頸鱗癌的患者1 021例，患者年齡21～90歲，平均(53.5±7.7)歲。本研究經過南京中醫院倫理委員會批準(批準號：2012NJL008)。由一位病理科副主任醫師和一位主治醫師根據WHO(2003年)婦科腫瘤組織學的分類標準進行復片，并復習其臨床病理資料。

1.2儀器與試劑 PCR儀為美國Life Technology公司生產的ABI7500型，高速冷凍離心機為德國eppendorf公司生產的5810 R型，分子雜交儀為江蘇省興化市分析儀器廠生產的FYY-3型，-20 ℃冰箱由青島海爾有限公司生產。HPV基因分型檢測試劑盒,由亞能生物技術(深圳)有限公司提供。顯色液需新鮮配制，使用時所需濃度加蒸餾水配制。

1.3方法

1.3.1標本的采集 先去除每例石蠟組織周邊多余的石蠟，將其石蠟組織切成4 μm厚的切片，切3～5片石蠟組織即可。用專用的鑷子輕輕夾取，放入小離心管中，切第2例石蠟組織前，用次氯酸鈉溶液擦刀片及鑷子各3次。

1.3.2DNA的提取 將切下的石蠟組織片放入1.5 mL離心管中，加入裂解液150 μL，充分振蕩混勻，放入金屬浴中加熱100 ℃ 10 min，立刻13 000 r/min離心10 min，離心半徑7 cm。取中間層DNA溶液待用。PCR擴增、雜交、孵育和顯色按說明書進行規范操作。每份標本顯色后，根據膜芯片上的各個型別位點雜交信號的有無，來判斷結果。低危型：6、11、42、43、81、83型，其他型別均為高危型。

1.4統計學處理 應用統計軟件包 SPSS19.0對相關數據進行統計學分析，計數資料以率表示，單一型別檢出率與多種型別檢出率及九價疫苗的保護譜與二價疫苗的保護譜兩者之間的比較采用χ2檢驗。以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1宮頸鱗癌組織中HPV感染基因型分布狀況 1 021例宮頸鱗癌組織中檢出HPV陽性者937例，總檢出率為91.77%(937/1 021)，單一型別感染者770例，單一型別檢出率為75.42%(770/1 021)，多種型別感染者167例(其中2型感染者130例，3型感染者29例，4、5、6型感染者各2例，7、9型感染者各1例)，多種型別檢出率為16.36%(167/1 021)。937例HPV陽性者中，檢出不同型別HPV檢出頻率數合計1 163次，其中低危型HPV檢出頻率數合計53次，高危型HPV檢出頻率數合計1 110次。單一型別感染者中高危型HPV前8位依次是16型為69.74%(537/770)、18型為6.88%(53/770)、58型為5.97%(46/770)、52型為3.77%(29/770)、31型為3.64%(28/770)、33型為3.25%(25/770)、59型為2.34%(18/770)、45型為1.17%(9/770)；多種型別感染者中HPV前8位依次是16+18型為19.16%(32/167)、16+58型為6.59%(11/167)、16+52型為5.99%(10/167)、16+33型為5.39%(9/167)、11+16型為2.99%(5/167)、16+31型為2.99%(5/167)、16+45型為2.99%(5/167)、16+42型為2.40%(4/167)、16+59型為2.40%(4/167)。宮頸鱗癌組織高危型HPV前8位檢出頻率的依次分別是16型為57.52%、18型為9.29%、58型為6.88%、52型為4.64%、33型為3.96%、31型為3.78%、59型為2.75%、45型為1.72%，其他HPV型別的檢出頻率為9.46%。HPV各單一型別檢出率及各型別檢出頻率見表1。

2.2宮頸鱗癌組織中單一型別與多種型別HPV檢出率及九價和二價HPV疫苗保護譜的比較 1 021例宮頸鱗癌組織中HPV陽性者為937例，其中單一型別HPV檢出者770例，多種型別HPV檢出者167例，單一型別與多種型別HPV檢出率比較，差異有統計學意義(75.42%vs. 16.36%,P<0.05)；對770例單一型別與167例多種型別HPV感染者，九價HPV疫苗(6、11、16、18、31、33、45、52和58型)的保護譜與二價HPV疫苗(16和18型)的保護譜比較，差異有統計學意義(90.82%vs.68.52%，P<0.05)。

表1 宮頸鱗癌組織中HPV單一型別型檢出率和各型別檢出頻率

3 討 論

在世界范圍內，導致宮頸鱗癌的高危HPV型別、分布比例及致癌風險度的判斷都是以宮頸鱗癌組織標本檢出的結果作為標準的。低危型HPV(6、11、42、43、81、83型等)極少出現于宮頸鱗癌組織中，高危型HPV，包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59型等與宮頸鱗癌發生密切相關，其中HPV16和18型是宮頸鱗癌組織中最常見的型別，其致癌風險位居前兩位[1，5]。宮頸鱗癌組織中高危型HPV16和18型感染在全球很普遍，各國之間沒有明顯的地區和種族差異性，分別占高危HPV檢出率的前兩位，只是檢出率有差異，而其他一些HPV型別確存在著地理位置和種族上的差異性[5-6]。由于高危HPV各型別致宮頸鱗癌風險度存在著差異性，弄清楚各主要致癌的高危HPV型別的分布狀況意義重大。因此，WHO建議各國都應建立起本國的宮頸鱗癌組織的HPV分型數據庫，這將對各國宮頸鱗癌的防治及宮頸鱗癌HPV預防性疫苗的研制都具有重要指導意義。

3.1宮頸鱗癌組織中HPV檢出率、各型別檢出頻率分布狀況 一項38個國家收集了8 977例宮頸癌石蠟組織標本大樣本研究提示HPV檢出率為85%，其中檢出最常見的HPV是16、18、31、33、35、45、52、58型，這8種HPV型別占總檢出率的91%[5]。本研究1 021例宮頸鱗癌組織中總的HPV檢出率為91.77%，其中單一型別檢出率為75.42%，多種型別檢出率為16.36%，宮頸鱗癌組織中高危型HPV前8位檢出頻率依次分別是16型為57.52%、18型為9.29%、58型為6.88%、52型為4.64%、33型為3.96%、31型為3.78%、59型為2.75%、45型為1.72%，這8種HPV型別占總檢出頻率的90.54%。本研究宮頸鱗癌組織中總的HPV檢出率高于上述宮頸癌組織大樣本研究，而8種HPV型別檢出頻率與上述大樣本研究總檢出率非常接近，型別略有不同，大樣本中出現了35型，本研究中出現了59型。這可能與兩組研究使用的HPV檢測方法不同，或收集的標本種類和數量以及地域和種族的不同有關。

本研究宮頸鱗癌組織中高危型HPV前8位單一型別檢出率和各型別檢出頻率排序比較，除31型和33型在兩者間位置互換外，其他型別排序相同，多種型別HPV的檢出率和檢出頻率排序比較，只是45型多種型別略高于59型多種型別，其他型別排序相同。由于高危型HPV在引起宮頸癌時，各種型別的致癌風險度存在著顯著的差異性，其在全球范圍內各國各地區常見的致癌型高危HPV型別也存在著差異性[5，7-9]。因此，弄清楚各國各地區宮頸癌組織中常見的高危型HPV感染分布比，有利于臨床婦科醫師對宮頸上皮內瘤變行HPV感染型別致癌風險度的評估和判斷，以便盡早阻斷此病變的進展，也有利于各國研制適合本國國情的宮頸鱗癌HPV感染譜的多價HPV預防性疫苗。

3.2宮頸鱗癌組織中高危型HPV感染型別分布與宮頸鱗癌的預防 檢測宮頸鱗癌組織中高危HPV感染型別分布的意義在于它提供了各國或各個地區導致宮頸鱗癌的各主要高危HPV型別、比例以及各高危型別致癌的風險度。宮頸鱗癌都有一個從正常宮頸組織到宮頸上皮內瘤變,再到宮頸浸潤性鱗癌的連續發展的過程。高危型HPV持續感染是宮頸鱗癌及宮頸上皮內瘤變的重要致病原因，其與宮頸鱗癌的發生、發展有著密切的關系。因此，正確判斷宮頸上皮內瘤變病變的進展風險，尋找宮頸上皮內瘤變進展的影響因子，構建宮頸上皮內瘤變致癌進展的預警模式已日益受到臨床婦科醫師的關注。

依據循證醫學原則，弄清我國區域性宮頸鱗癌組織中高危HPV感染型別分布有利于臨床婦科醫師對宮頸上皮內瘤變的逆轉或進展做出預判和評估。因此，臨床上高危HPV分型檢測和宮頸上皮內瘤變的進展預警受到了前所未有的重視。一項關于預防浸潤性宮頸癌的大樣本隨機對照試驗發現，高危HPV單項篩查效果比細胞學單項檢查效果高60%～70%，該研究支持對年齡大于30歲女性開展時間間隔不少于5年的高危HPV篩查[10]。研究發現大多數宮頸上皮內瘤變(95.90%)復發病例與特定型別的高危HPV持續感染有關，其中74.50%是高危HPV16和18型持續感染，高危HPV31和33型在宮頸上皮內瘤變Ⅱ+復發患者中的感染率較低。高危HPV16和18型持續感染較其他高危HPV感染者，兩次宮頸錐切間隔時間要短，預示著更早更容易復發[11]。一項Meta分析發現雖然宮頸上皮內瘤變Ⅱ+治療后高危HPV16型陽性者疾病復發風險最高，HPV16型感染所致的宮頸上皮內瘤變Ⅱ+不太可能自然消退，一旦確診應及時治療，但其他非常見型別高危HPV陽性(不是HPV16、18、31、33和45型)患者宮頸上皮內瘤變Ⅱ+的累積復發率也高達30%，故臨床上非常見型別高危HPV的持續感染也不可忽視[12]。

與本研究宮頸鱗癌組織中高危HPV16和18型風險度排序前兩位(兩者檢出頻率為66.81%)，而高危HPV33和31型排在第5和第6位(兩者檢出頻率為7.74%)風險度偏低的狀況相吻合。在我國要重視區域性排名第3和第4位的高危HPV58和52型(兩者檢出頻率為11.52%)，兼顧高危HPV59和45型(檢出頻率分別為2.75%和1.72%)。因此，臨床上對女性行宮頸高危HPV分型檢測，是30歲以上的女性感染風險度高的高危HPV感染者，是否行陰道鏡檢查及是否給予密切隨訪的一項重要的參考指標。

3．3宮頸鱗癌HPV各型別分布與HPV預防性疫苗保護譜的關系 對全球各國宮頸癌組織標本研究發現，高危HPV16型和18型感染率最高，在檢出的所有高危HPV型別中，HPV16型檢出率占50%，HPV18型檢出率占14%，HPV45型檢出率占8%，HPV31型檢出率占5%，其他HPV型別檢出率占23%。我國宮頸癌組織HPV感染型別中，52和58型檢出率較高。HPV45型在非洲西部宮頸癌組織中很常見，而HPV39型和59型僅在美洲中部和南部宮頸癌組織中出現較多[5，13-14]。本研究以江蘇省為主的區域性宮頸鱗癌組織中HPV感染基因型檢出頻率依次是是16型為57.52%、18型為9.29%、58型為6.88%、52型為4.64%、33型為3.96%、31型為3.78%、59型為2.75%、45型為1.72%，其他HPV型別的檢出頻率僅為9.46%。與上述全球各國宮頸癌組織各型別HPV感染所占比比較，除16和18型排序相同外，其他各型別均有不同，且型別所占的比例也有不同，國外45型排序第3位，所占比例也比較高，本研究45型排序靠后(第8位)，所占比例也比較低。58和52型是本文宮頸癌組織中次重要的兩個型別(兩者檢出頻率為11.52%)，本研究中59型比45型常見，檢出頻率比45型高1.03%，如果我國研制九價HPV預防性疫苗應該將59型納入其中，而不是45型。接種HPV預防性疫苗是宮頸癌的一級預防策略，二價預防性HPV疫苗對本研究宮頸鱗癌的患者的保護譜為68.52%(642/937)，九價預防性HPV疫苗對宮頸鱗癌的患者的保護譜為90.82%(851/937)，兩種預防性HPV疫苗保護譜比較，差異有統計學意義(P<0.05)。建議女性如果接種HPV預防性疫苗的話，最好選擇接種九價疫苗，實現一次接種，可獲得最大化的疫苗保護譜。

綜上所述，宮頸癌致癌HPV型別風險度的確定是以宮頸癌組織標本檢出的結果作為金標準的。本研究宮頸鱗癌組織中HPV感染檢出頻率前8位排序依次是16、18、58、52、33、31、59和45型。在全球范圍內，高危HPV16和18型是致宮頸鱗癌風險度最高的兩種型別，且排序相同，由于HPV感染存在著地域和種族上的差異性，其他致癌HPV型別的排序不盡相同，且各型別檢出頻率也存在著差異，因此，世界各國都應建立本國的宮頸鱗癌組織HPV感染分型大數據庫[15-17]。2006年起西方國家先后批準接種二價、四價(6、11、16和18型)和九價HPV預防性疫苗，十年后，我國于2016年先后批準上市了二價、四價和九價(有條件上市)預防性HPV疫苗，這些預防性疫苗都是國外公司在我國上市的產品。我國女性如接種HPV預防性疫苗的話，建議選擇接種九價疫苗，一次接種，可獲得最大化的保護譜。目前，我國尚沒有宮頸鱗癌組織的大樣本HPV感染分型數據庫，無論HPV檢測試劑的研發，還是HPV預防性疫苗的研制都是依據國外的資料。因此，盡快建立起我國自己的宮頸鱗癌組織HPV感染分型數據庫是非常必要的，這有利于臨床婦科醫師對宮頸上皮內瘤變的發展趨勢作出評估和預判，以便適時對患者行干預治療，也有利于我國宮頸鱗癌防治以及HPV試劑和HPV預防性疫苗的研制。

4 結 論

對女性宮頸鱗癌組織大標本行HPV分型檢測，有利于婦科醫師對宮頸上皮內瘤變HPV感染型別致癌風險度的判斷及防治，也有利于對感染了高致癌性HPV女性的隨訪工作及HPV疫苗的保護譜的評估。