抗苗勒管激素及其Ⅱ型受體基因多態(tài)性與隱睪癥關(guān)系的初步研究

曹 科，羅小娟△，沈 丹，姚 強(qiáng)，吳蘇偉，楊志林，陳運(yùn)生，馬東禮

(深圳市兒童醫(yī)院：1.檢驗科；2.泌尿外科，廣東深圳 518038)

隱睪是睪丸未能按正常發(fā)育過程從腰部腹膜后下降至陰囊底部，包括睪丸缺如、異位和下降不全[1]，是小兒外科常見的生殖系統(tǒng)先天性畸形，其病因復(fù)雜，眾多遺傳和內(nèi)分泌因素都參與了睪丸下降過程[2]。隱睪可能會引發(fā)睪丸萎縮、惡變及成年后男性不育和性功能障礙，嚴(yán)重影響男性生殖健康和心理健康而受到廣泛關(guān)注[3-6]。抗苗勒管激素(AMH)在男性由睪丸未成熟支持細(xì)胞分泌，具有調(diào)控生殖細(xì)胞生長發(fā)育、引起苗勒管退化及誘導(dǎo)睪丸下降等功能[7]。AMH主要是與抗苗勒管激素Ⅱ受體(AMHRⅡ)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[8]。本課題組前期研究表明隱睪患兒血清AMH水平顯著下降，是反映隱睪患兒睪丸發(fā)育狀況的一項重要指標(biāo)[9]。但AMH、AMHRⅡ基因多態(tài)性是否與隱睪發(fā)病相關(guān)，不同基因型之間血清AMH、睪酮(T)水平是否存在差異，尚不明確。本研究擬通過檢測隱睪患兒及健康兒童AMH和AMHRⅡ基因多態(tài)性及血清AMH、T激素水平，初步分析AMH和AMHRⅡ基因多態(tài)性與單、雙側(cè)隱睪癥及血清AMH、T水平的相關(guān)性，從基因多態(tài)性層面初步探討兒童隱睪癥的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年4-8月在本院泌尿外科住院隱睪患兒49例，年齡9個月至7歲9個月，所有病例經(jīng)體格檢查、B超及手術(shù)探查得到確診。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合 2012 年我國小兒隱睪的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，所有入選病例均排除了尿道下裂、兩性畸形、睪丸外傷，術(shù)前均未使用激素藥物治療。所有病例均為低位型隱睪(患側(cè)睪丸在腹股溝管內(nèi)環(huán)口下側(cè)與陰囊上側(cè)之間)。按隱睪睪丸的類型分為單側(cè)隱睪組和雙側(cè)隱睪組。術(shù)中發(fā)現(xiàn)：單側(cè)隱睪中，29例可以一次手術(shù)固定至陰囊，1例需要分期手術(shù)，術(shù)中發(fā)現(xiàn)1例隱睪嚴(yán)重發(fā)育不良，3例為單睪癥；雙側(cè)隱睪中18例可以一次手術(shù)固定至陰囊，1例需分期手術(shù)，術(shù)中發(fā)現(xiàn)1例單側(cè)隱睪嚴(yán)重發(fā)育不良。同時選取同年齡段40例(9個月至8歲3個月)保健科體檢健康男童作為對照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：無腹股溝斜疝、隱睪、尿道下裂、精索靜脈曲張、鞘膜積液、兩性畸形、睪丸外傷、性早熟等病史，無腹股溝區(qū)外傷手術(shù)史。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2試驗方法

1.2.1標(biāo)本采集 所有兒童清晨空腹抽取靜脈血6 mL，其中乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血2 mL標(biāo)本，分離膠促凝管4 mL標(biāo)本，分離膠促凝管標(biāo)本經(jīng)3 000 r/min離心10 min后取上層血清，抗凝全血和血清標(biāo)本置于-20 ℃冰箱保存待測，抗凝全血和血清標(biāo)本均為常規(guī)項目檢測后的剩余標(biāo)本。

1.2.2血清AMH、T水平測定 采用上海心語生物科技有限公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒檢測AMH、T水平，AMH試劑盒的線性范圍為0.8～35 ng/mL，T試劑盒的線性范圍為0.4～18 nmol/L，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.3AMH和AMHRⅡ基因序列聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及測序 采用Qiagen DNA Mini試劑盒提取DNA(嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行)，AMH和AMHRⅡ4個基因多態(tài)性位點(diǎn)引物由Life Technology公司合成，引物序列見表1。珠海Hema 9600基因擴(kuò)增儀完成PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)總體積25 μL，包含2 μL 2.5 mmol/L dNTP，0.25 μL 20 mmol/L正向引物，0.25 μL 20 mmol/L反向引物，0.125 μL 5 U/μL Tag聚合酶，2.5 μL 10×Buffer，0.5 μL DNA模板，19.375 μL滅菌蒸餾水。擴(kuò)增反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，從變性至延伸共35個熱循環(huán)后，再72 ℃延伸2 min，12 ℃保存。反應(yīng)完成后，取5 μL用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增情況。PCR產(chǎn)物送Life Technology公司進(jìn)行產(chǎn)物純化和測序分析。AMH采用正向測序、AMHRⅡ采用反向測序。為保證分析的準(zhǔn)確性，每個SNP位點(diǎn)均分析兩次，兩次分析均顯示相同的結(jié)果。

表1 AMH 和AMHRⅡ4個基因多態(tài)性位點(diǎn)引物序列

2 結(jié) 果

2.1病例組與對照組基本信息比較 49例隱睪患兒中，單側(cè)隱睪30例(66.7%)，雙側(cè)隱睪19例(33.3%)。單側(cè)隱睪組年齡(3.0±2.4)歲與雙側(cè)隱睪組年齡(3.3±2.4)歲比較，病例組年齡(3.1±2.4)歲與對照組年齡(3.1±2.4)歲比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2病例組和對照組血清AMH、T水平比較 單側(cè)隱睪組AMH、T水平分別與雙側(cè)隱睪組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而對照組AMH、T水平均高于單側(cè)隱睪組和雙側(cè)隱睪組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3AMH和AMHRⅡ基因型分布及其等位基因頻率分布 病例組和對照組AMHRⅡ IVS 5-6 C>T、AMHRⅡ482 A>G基因型、等位基因頻率分布差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；病例組和對照組AMH Ile49Ser、AMHRⅡIVS 10+77 A>G基因型、等位基因頻率分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；單側(cè)隱睪組和雙側(cè)隱睪組AMH Ile49Ser、AMHRⅡIVS 10+77 A>G、AMHRⅡ IVS 5-6 C>T、AMHRⅡ482 A>G基因型、等位基因頻率分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 血清AMH、T水平比較

注：▲與雙側(cè)隱睪組比較，△單、雙側(cè)隱睪組分別與對照組比較，P<0.05

表3 AMH和AMHRⅡ基因型及其等位基因頻率分布[n(%)]

續(xù)表3 AMH和AMHRⅡ基因型及其等位基因頻率分布[n(%)]

表4 不同AMH Ile49Ser基因型對應(yīng)血清AMH、T水平比較

續(xù)表4 不同AMH Ile49Ser基因型對應(yīng)血清AMH、T水平比較

表5 不同AMHRⅡIVS10+77A>G基因型對應(yīng)血清AMH、T水平比較

表6 不同AMHRⅡ IVS 5-6C>T基因型對應(yīng)血清AMH、T水平比較

表7 不同AMHRⅡ482 A > G基因型對應(yīng)血清AMH、T水平比較

2.4不同AMH、AMHRⅡ基因型對應(yīng)血清AMH、T水平比較 單側(cè)隱睪組內(nèi)、雙側(cè)隱睪組內(nèi)、病例組內(nèi)、對照組內(nèi)AMH、AMHRⅡ不同基因型之間血清AMH和T水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4～7。

3 討 論

抗苗勒管激素又名苗勒抑制物(MIS)，在男性，AMH主要由未成熟睪丸支持細(xì)胞(Sertoli cell)分泌，而T主要由成熟睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig cell)分泌。因此，測定血清AMH和T水平可以分別反映睪丸支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)、發(fā)育程度。本研究結(jié)果顯示，病例組血清AMH、T水平均低于對照組，說明隱睪患兒的睪丸功能受到了損害，這與GRINSPON等[10]、MATUSZCZAK等[11]的研究結(jié)果相一致。同時筆者發(fā)現(xiàn)，雙側(cè)隱睪組血清AMH、T水平均低于單側(cè)隱睪組，表明雙側(cè)睪丸未降者，其睪丸受損程度大于單側(cè)睪丸未降者，這與HAMDI等[12]研究結(jié)論一致，而與VAN BRAKEL等[13]、KOMAROWSKA等[14]的研究結(jié)果不太一致，可能與各研究所選取的研究對象數(shù)量、年齡、隱睪類型不同等因素有關(guān)。

基因組單個核苷酸A/T/C/G的改變而引起的DNA序列的改變，造成包括人類在內(nèi)的物種之間染色體基因組DNA序列的多樣性，即單核苷酸多態(tài)性(SNP)。它是人類可遺傳變異中最常見的一種，SNP分析對疾病的易感性、早期風(fēng)險性評估、預(yù)防、診斷和治療等各方面均具有重要的作用和價值。既往研究表明，AXIN1[15]、IL-27[16]、IL-21[17]、INSL3[18]、HOXA11[19]、RXFP2[18]等基因多態(tài)性與隱睪癥的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，AMH、AMHRⅡ基因型分布情況與KOMAROWSKA等[14]研究結(jié)果相似，說明中國人與歐洲人的頻率分布相似，不存在人種差異，但與其不同的是，筆者發(fā)現(xiàn)并不是所有IVS 5-6 C>T純合子和雜合突變的病例都伴隨有IVS10+77A>G和482A>G純合子和雜合突變，這可能與人種差異有關(guān)。本研究顯示隱睪病例組AMHRⅡ IVS 5-6 C>T、AMHRⅡ482 A>G基因型及等位基因頻率分布與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示AMHRⅡ IVS 5-6 C>T、AMHRⅡ482 A>G可能與隱睪發(fā)病有關(guān)。但不同基因型之間血清AMH和T水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示血清AMH和T水平并不受AMH、AMHRⅡ基因多態(tài)性影響。

本研究表明隱睪患兒血清AMH水平顯著下降，但未發(fā)現(xiàn)AMH基因多態(tài)性與隱睪發(fā)病具有相關(guān)性。可能與其SNP位點(diǎn)的選擇有關(guān)，在EXAC數(shù)據(jù)庫中查到的AMH基因的錯位突變位點(diǎn)有189個，分布于基因組不同區(qū)域，位于啟動子區(qū)域的位點(diǎn)可參與AMH的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，編碼區(qū)的SNP可影響翻譯后關(guān)鍵功能基團(tuán)的氨基酸序列，從而影響蛋白質(zhì)的功能，最終導(dǎo)致對病因或特定環(huán)境的反應(yīng)敏感性，而內(nèi)含子區(qū)域SNP可通過影響基因剪接、信使RNA降解、轉(zhuǎn)錄子結(jié)合、非編碼區(qū)RNA序列或與其他相關(guān)的SNP位點(diǎn)共同作用等最終影響基因功能。本研究只選取了AMH Ile49Ser非同義SNP位點(diǎn)，其改變了編碼的氨基酸種類，導(dǎo)致第49位的異亮氨酸Ile為絲氨酸Ser所取代，雖然研究結(jié)果提示AMH Ile49Ser在研究地區(qū)兒童隱睪癥發(fā)病無明顯作用，但仍不能排除SNP位點(diǎn)的局限性，且可能存在多個位點(diǎn)相互共同作用進(jìn)而影響實(shí)驗結(jié)果。隱睪是導(dǎo)致男性不育、睪丸腫瘤的重要因素，AMH和AMH RⅡ基因多態(tài)性是否可以作為遺傳標(biāo)記用于隱睪的基因診斷并預(yù)測不育癥及睪丸腫瘤等，尚有待于今后擴(kuò)大樣本量更深一步的研究和探討。

4 結(jié) 論

AMH、AMHRⅡ基因多態(tài)性是否與隱睪發(fā)病相關(guān)研究甚少報道，不同基因型之間血清AMH、T水平是否存在差異，尚不明確，筆者檢測了隱睪患者和健康對照兒童AMH和AMHRⅡ基因多態(tài)性及血清AMH、T激素水平，發(fā)現(xiàn)AMHRⅡ IVS 5-6 C>T、AMHRⅡ482 A>G可能與隱睪發(fā)病有關(guān)。隱睪患兒血清AMH、T水平顯著低于對照組，但不受AMH、AMHRⅡ基因多態(tài)性影響。