賀州地區16 751例女性人乳頭瘤病毒感染及基因分型分析

彭小媚,陳 棟，陳善昌，林永恩

(廣西壯族自治區賀州市人民醫院檢驗科，廣西賀州 542800)

宮頸癌是婦女常見的惡性腫瘤之一,是世界范圍內的主要公共衛生問題[1]，嚴重危害婦女的生命健康。在世界范圍內,宮頸癌是女性的第四大惡性腫瘤,約占影響女性的所有類型惡性腫瘤的12%[2]，全球每年新增宮頸癌人數已超50萬，死亡人數亦超20萬[3]，且發病年齡日益年輕化，是威脅婦女生命健康的重要因素之一。根據我國癌癥統計數據顯示,2015年子宮頸癌新發病例數約為9.89萬例,死亡人數約300萬例[4]。人乳頭瘤病毒(HPV)是一種嗜上皮性病毒，在人和動物中分布廣泛，有高度的特異性，持續感染是女性宮頸病變的主要原因。HPV感染引起的癌癥，主要是黏膜和皮膚的鱗狀細胞癌(SCC)[5]。HPV是誘導宮頸上皮細胞轉變為癌前病變或癌癥的最重要因素，HPV感染狀態是宮頸癌篩查中的關鍵因素。因此，HPV檢測已成為一種重要的篩查工具[6]。現已發現導致人類感染的HPV有100多種型別，而不同型別的感染與宮頸疾病的發生不盡相同，根據與宮頸癌發生的相關性進行分析，國際腫瘤研究所根據其致癌性與否將HPV亞型分為高危型和低危型兩類[7]。大量研究已證實，高危型HPV的持續感染是宮頸癌發生的重要因素[8-9]，99%的宮頸癌患者檢測出HPV高危亞型感染。有效的醫學干預能夠降低宮頸癌的發病率，及早發現HPV感染分型對提前進行防治有重要的臨床意義。研究表明HPV亞型分布與地區、環境、人群等因素相關[10]，為了解賀州地區HPV基因分型及流行分布情況，本研究采用基因芯片技術對本院就診的16 751例婦女的宮頸脫落細胞標本進行基因分型檢測，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2012年1月至2018年9月本院婦科就診及體檢健康者，年齡10～92歲，平均(38.5±10.6)歲，自愿接受生殖道HPV感染篩查的女性宮頸脫落細胞標本為16 751例，已剔除復診病例。

1.2儀器與試劑 PCR擴增儀黑馬9600購自珠海黑馬醫學儀器公司，分子雜交儀Combi_H12購自深圳亞能公司，熱循環儀K960購自杭州晶格科學儀器有限公司。HPV基因分型檢測試劑盒為深圳亞能生物技術有限公司產品。該試劑醫療器械注冊證書編號為:國食藥監械(準)字2014第3401227號，其特異度、靈敏度分別為95.36%和96.36%，能夠滿足實驗檢測需要。

1.3實驗方法

1.3.1樣本的采集與保存 以專用宮頸脫落細胞采集器進行采樣。醫護人員先以窺陰器或陰道張開器暴露宮頸，用棉拭子將宮頸口過多的分泌物擦去。取出宮頸刷置于宮頸口，單方向旋轉4～5周以獲得足量的上皮細胞樣本，然后將宮頸刷頭部放入洗脫管中，沿刷柄折痕處將宮頸刷柄折斷，旋緊洗脫管蓋，洗脫管中已加有專用細胞保存液，做好樣本標識4 ℃保存待檢，保存不超過24 h。-20 ℃保存不超過3個月，樣本應避免反復凍融。

1.3.2HPV-DNA的提取 充分洗脫宮頸刷，并在管壁上擠干。把洗脫液全部轉移到1.5 mL離心管中，13 000 r/min,離心10 min,棄去上清液，保留管底的細胞沉淀。加入50 μL裂解液懸浮沉淀，沸水浴加熱10 min，13 000 r/min,離心10 min，保留上清液待用。

1.3.3聚合酶鏈反應(PCR)擴增 取出反應液1及反應液2各1管，做好標記，低速離心數秒，然后分別加入已提取的待測樣品DNA 5 μL，反應總體系為25 μL，低速離心數秒待PCR擴增。PCR按以下條件進行擴增:50 ℃ 15 min;95 ℃ 10 min;然后以94 ℃ 30 s;42 ℃ 90 s;72 ℃ 30 s，40個循環;72 ℃延伸5 min。

1.3.4雜交 取15 mL塑料離心管，放入標有患者編號的膜條，加入A液5～6 mL及所有對應的PCR產物，將蓋擰緊。將離心管放入沸水浴中加熱10 min，取出放入雜交箱51 ℃雜交1.5 h。

1.3.5膜條處理 洗膜取出膜條，移至裝有B液的50 mL管中，于51 ℃輕搖洗滌5 min。

1.3.6顯色及結果判定 按HPV基因分型檢測試劑盒說明進行雜交顯色，顯色結果亦按說明書進行判定。膜條上探針按固定順序排列，由藍色斑點顯現位置即可斷定HPV的亞型。其中，高危型17種包括:HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82;低危型6種包括:HPV6、11、42、43、81、83。PC為顯色質控點。

1.4統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行統計分析，計數資料以率(%)表示，進行χ2檢驗分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1不同年份檢測情況及感染率 2012-2018年，本院HPV項目就診及體檢人數分別為812、766、853、1 943、3 972、4 470、3 935例，隨著宮頸癌科普知識的宣傳及婦女對自身健康體檢需求增加，HPV檢測人數有逐年增加趨勢，但是感染率逐年減低。16 751例受檢人數共檢測陽性病例4 568例，HPV感染率為27.27%。見表1。

表1 2012-2018年賀州市HPV受檢人數及感染率

2.2HPV感染各亞型分布狀況 16 751例女性中有4 568例感染HPV，檢出頻數最高的型別是HPV52型，檢出構成比為16.77%(1 011/6 029)，也是單一陽性率及多重陽性率最高的亞型，分別為18.62%(629/3 378)和14.41%(382/2 651)；HPV各亞型的構成比中排在前3位的是HPV52、16、58，感染率明顯高于其他亞型，構成比分別為16.77%、14.21%、8.46%。見表2。

表2 4 568例感染者HPV各亞型構成情況

2.3不同年齡組HPV感染狀況分析 16 751例送檢者年齡為10～92歲，以25～49歲最多，共12 532例，占74.81%。在所有年齡組中<20歲年齡組感染率最高，達56.86%；其次是≥55歲年齡組，感染率為41.54%；35～39歲年齡組感染率相對較低，感染率為22.48%。<20歲年齡組HPV感染率與其他各年齡組差異均有統計學意義(P<0.01)。≥55歲年齡組與25～54歲年齡組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，與<25歲年齡組相比較，差異無統計學意義(P>0.05)。≥55歲年齡組高危型明顯高于其他年齡組30.77%，<20歲組的低危型、高低危混合型感染率均明顯高于其他年齡組，分別為18.14%和22.55%。其他年齡組中感染率相對較高的有:50～54歲年齡組單純高危型感染率為22.22%；20～24歲年齡組單純低危型感染為9.09%；高低危混合型中也是以≥55歲年齡組較高，占7.09%。見表3。

2.4HPV單一感染和多重感染分布狀況 HPV感染存在多種亞型同時感染的情況，不同年齡組均可出現HPV單一感染和多重感染情況,以單一感染病例為主，在HPV陽性病例中檢出單一型感染病例3 359例,占73.53%(3 359/4 568)；二重感染為兩種亞型陽性，占18.89%(863/4 568)，HPV多重感染指同時感染HPV 3種及以上亞型病例，其中三重感染占5.06%(231/4 568)，四重感染占1.58%(72/4 568)，五重及以上感染占0.94%(43/4 568)。單一型感染中35～39歲組感染率最高為82.79%(486/587)，35～39歲年齡組單一型感染率與<30歲及≥50歲年齡組差異有統計學意義(P<0.05)。與30～34歲、40～49歲年齡組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。二重感染中20～24歲組感染率最高為24.79%(90/363)，20～24歲組二重感染率與30～54歲年齡組差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表3 不同年齡組HPV感染狀況

表4 HPV 單一感染和多重感染在各年齡組的感染率

3 討 論

本研究應用基因芯片技術對賀州地區女性的HPV感染情況進行了大規模樣本的調查，實驗結果顯示2012-2018年檢測人數及陽性人數持續增加,而感染率逐年降低。分析原因可能是患者及醫生對HPV檢測及防御意識增加。16 751例樣本中HPV感染者4 568例，感染率為27.27%，調查結果與中國西南地區(26.2%)[11]、浙江省湖州地區(26.83%)[12]、上海地區(28.5%)[13]及山東地區(29.00%)[14]較接近，明顯高于成都地區(17.60%)[15]、武漢地區(17.46%)[16]、珠海地區(21.37%)[17]，明顯低于遼寧地區(45.60%)[18]、重慶地區(37.30%)[19]及廣州地區(35.00%)[20]，提示HPV感染在不同地區有較大差異，亞型的分布在各地區較為一致。HPV各亞型在4 568例陽性樣本中HPV52、16、58感染率明顯高于其他亞型，分別為16.77%、14.21%、8.46%，說明這3種亞型是易感亞型，結果與我國其他地區報道一致[21]，也符合亞洲人群研究結果，在亞洲宮頸癌病例中，HPV58比歐洲及非洲更為常見。但與國外人群有差異，美國感染率前3位基因型為HPV16、53、52[22]，芬蘭為HPV16、31、52[23]。而這3種亞型都為高危型，應該重點關注，加強防范，該研究對該地區HPV疫苗的研制重點起到了較好的提示作用。16 751例送檢者年齡為10～92歲，以25～49歲最多，共12 532例，占74.81%,說明該年齡段人群對HPV篩查有較強的意識，對早發現、早治療起到了較好的預防作用。在所有年齡組中<20歲年齡組陽性率最高，達56.86%，可以看出該年齡段人群為HPV感染的易感人群，而該年齡段人群的自我保護意識較差，對HPV篩查的認識還不到位，應加強該人群的自我保護意識，對該人群加大宣傳HPV篩查重要性的力度，及時接種HPV疫苗；其次是≥55歲年齡組，感染率為41.54%，可能與該人群的免疫力下降有關;35～39歲年齡組感染率相對較低，說明該年齡段人群的自我保護意識、HPV篩查意識和免疫力較強。

HPV單一感染占73.53%，二重感染為兩種亞型陽性，占18.89%，三重感染占5.06%，四重感染占1.58%，五重及以上感染占0.94%。說明HPV感染亞型以單一亞型感染為主，與國內報道的單一感染是HPV感染的主要形式一致[24-25]，單一亞型感染率最高的是35～39歲年齡組，為82.79%，與拉丁美洲、加勒比地區及非洲大多數國家報道的45歲不同[26]。有研究報道芬蘭有一個<25歲的高峰[23]。二重亞型感染率最高的是20～24歲年齡組為24.79%，可能與性行為，宿主易感性和病毒特征有關。三重及四重亞型感染率最高的均是<20歲年齡組，分別為14.41%和10.17%，說明該年齡段人群易感三重和四重亞型，可能與該人群的自我保護意識較差，對HPV的認知尚淺，且發育不成熟有關。五重及以上感染率最高的是≥55歲年齡組為3.13%，可能與該年齡段人群的生理絕經期和免疫力下降有關。

調查研究結果顯示，賀州地區HPV高危感染率占72.50%，低危感染占15.28%，高低危混合感染占12.22%，說明感染類型多以高危型為主。而在高危型感染人群中，又以≥55歲年齡組單純高危型為主，占30.77%，主要與該年齡段女性處于生理絕經期和免疫力下降導致HPV持續感染或潛伏感染病毒復活有關，且大部分因為有生殖道癥狀而就診。高風險HPV基因型感染是宮頸癌的重要危險因素[27]，體現出高風險HPV檢測的重要性[28]，隨著人口老齡化，絕經后的婦女是宮頸癌篩查策略中重點考慮的新群體。<20歲年齡組低危感染和高低危混合感染感染率最高，說明HPV感染有低齡化多亞型化傾向，此類感染人群感染率高，可能與宮頸環境未成熟，檢測標本數量少，且多數患者已有相應癥狀有關。持續HPV高危型感染是宮頸癌發生的必要條件，HPV檢查是目前預防及控制宮頸癌發生的主要手段，同時加強不同年齡段HPV疫苗接種。在美國，2015年，42%的女孩和28%的13～17歲男孩接受了所有3種疫苗劑量[29]。有調查顯示，在西安市第四醫院婦科門診單純隨機抽取前來就診的患者1 000例,采用自行設計的問卷進行調查，結果發現，西安市門診患者對HPV及其疫苗的知曉率較低,應加強公眾健康教育宣傳力度,普及HPV疫苗相關知識[30]。

4 結 論

賀州市HPV感染普遍存在于不同健康狀態的女性中,以單一感染高危型為主。本研究首次對賀州地區女性進行大樣本回顧性分析HPV感染和基因類型分析，HPV基因分型研究對于建立宮頸癌篩查和HPV疫苗接種策略非常重要,對賀州地區的宮頸癌的防治提供了科學的理論依據。