多囊卵巢綜合征患者血清和卵泡液中Adropin水平對胚胎發(fā)育質(zhì)量的影響

奚 迪，鄭英霞，劉 斌，匡樂樂，任懿倩，高玉平△

(上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院：1.生殖醫(yī)學中心；2.檢驗科,上海 200092)

夫婦同居且有正常性生活，未避孕1年以上未受孕稱為不孕癥[1]。《中國不孕不育現(xiàn)狀調(diào)研報告》指出，我國不孕不育癥患者高達15%～20%，且有年輕化趨勢[2]。

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡女性最常見的婦科內(nèi)分泌疾病，根據(jù)鹿特丹標準[3]，我國育齡婦女患病率為5.6%[4]。PCOS以稀發(fā)或無排卵、高雄激素血癥、卵巢多囊樣變?yōu)樘卣鱗5]，嚴重影響了女性的生育能力。而尋求輔助生殖技術(ART)助孕的PCOS患者通常臨床結局較差，易發(fā)生卵子成熟障礙、受精障礙等問題。

2008年KUMAR等[6]發(fā)現(xiàn)由能量穩(wěn)態(tài)相關基因(Enho)編碼的分泌性蛋白Adropin，但其詳細作用機制及機體代謝途徑尚未明確[7]。在以往的研究中，Adropin已被發(fā)現(xiàn)在與PCOS相關疾病如代謝綜合征[8-9]、糖尿病[10]、子宮內(nèi)膜癌[11]及心血管疾病[12-13]中具有臨床應用價值，推測它在PCOS相關的不孕癥中也具有研究前景。

本研究旨在分析PCOS患者的血清和卵泡液中Adropin的表達水平與各臨床指標的關系，及對體外受精(IVF)胚胎質(zhì)量的預測價值，為臨床早期預計PCOS患者ART結局提供實驗依據(jù)和參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究納入2017年9月至2018年8月在本院生殖醫(yī)學中心首次進行IVF助孕的患者共60例。受試者均簽署知情同意書。

PCOS組納入標準主要參照2003年鹿特丹標準[5]，同時參考PCOS中國診療指南：患者必須有月經(jīng)稀發(fā)或無排卵或不規(guī)則子宮出血。另外再符合高雄激素血癥(臨床性和生化性)或卵巢多囊樣病變中的1項，同時逐一排除可能引起高雄激素的疾病和引起排卵異常的疾病。排除標準：(1)庫欣綜合征；(2)非經(jīng)典型先天性腎上腺皮質(zhì)增生(NCCAH)；(3)卵巢或腎上腺分泌雄激素的腫瘤；(4)功能性下丘腦性閉經(jīng)；(5)甲狀腺疾病；(6)高泌乳素血癥；(7)早發(fā)性卵巢功能不全(POI)。

對照組納入標準：因輸卵管因素進行IVF助孕、月經(jīng)周期和排卵有規(guī)律的不孕癥患者；年齡匹配、促排方案與PCOS組一致，同時排除PCOS及其他可能引起高雄激素的疾病和引起排卵異常的疾病。

所有患者需同時排除：(1)男方重度少精、弱精、畸形精子癥等男性因素不育；(2)重度子宮內(nèi)膜異位癥；(3)既往卵巢病變史或卵巢手術；(4)生殖系統(tǒng)惡性腫瘤；(5)遺傳病家族史；(6)體外受精-胚胎移植(IVF-ET)禁忌證。

1.2研究方法

1.2.1促排卵方案 所有患者采用拮抗劑方案進行促排卵。自患者月經(jīng)第3天，B超卵巢處于基礎狀態(tài)，開始每天肌肉注射促性腺激素(Gn)：重組人促卵泡素 r-FSH(普利康600 IU/支，MSD)。根據(jù)患者體質(zhì)量肌肉注射150～250 IU/d，用藥5 d后，根據(jù)卵巢的反應[B超監(jiān)測卵泡大小及血清促黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)及孕酮(P)水平]調(diào)整Gn劑量，當優(yōu)勢卵泡≥14 mm或LH≥10 IU/L時加用拮抗劑(思則凱0.25 mg/支，MerckSerono) 0.25 mg/d至人絨毛促性腺激素(HCG)日(包括 HCG日)。

1.2.2觸發(fā)方案 當至少1個卵泡直徑≥18 mm或2個卵泡直徑≥17 mm，結合血清E2、LH和P水平?jīng)Q定停用促性腺激素。若患者中重度卵巢過度刺激征(OHSS)的發(fā)生風險不高，給予肌肉注射HCG 5 000～10 000 U，具體劑量根據(jù)HCG日的卵泡數(shù)量決定。肌肉注射HCG 35～36 h后在陰道B超引導下取卵，卵母細胞在體外培養(yǎng)4～6 h后進行常規(guī)體外受精或單精子胞漿內(nèi)注射。取卵當日給予黃體支持，肌肉注射黃體酮針劑 80 mg/d。

1.2.3標本采集 分別在患者促排卵周期的月經(jīng)第3天、HCG日以及取卵日早晨8點肘靜脈采血3.0 mL，1 000×g離心15 min后取血清標本，分裝后于-80 ℃保存待測；取卵日通過B超下細針穿刺術穿刺患者第一個優(yōu)勢卵泡，獲得無稀釋、未被血液污染的第一管卵泡液，經(jīng)實驗室撿卵后充分混勻，1 000×g離心15 min后取上清液，分裝后于-80 ℃保存待測。

1.3儀器與試劑 采用全自動微粒子化學發(fā)光儀及配套試劑(貝克曼庫爾特，美國)運用酶化學發(fā)光法檢測血清E2、LH、卵泡生成素(FSH)、P、催乳素(PRL)、睪酮(T)和胰島素(INS)水平；采用全自動生化分析儀及配套試劑(日立，日本)運用己糖激酶法檢測血清葡萄糖(Glu)水平；采用全自動化學發(fā)光免疫分析儀及其配套試劑(西門子，德國)檢測血清促甲狀腺激素(TSH)水平；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(華美生物，中國武漢)檢測血清及卵泡液Adropin水平(賽默飛世爾酶標儀，美國)。

1.4方法 按儀器及試劑說明書操作。使用人Adropin(ENHO)酶聯(lián)免疫試劑盒檢測Adropin水平：用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，于包被ENHO抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的ENHO抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色，顏色的深淺和樣本中的ENHO呈正相關性。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(A值)，計算樣本水平。

2 結 果

2.1PCOS患者的Adropin水平及臨床參數(shù) PCOS組患者基礎LH值、空腹INS水平、HCG日E2值明顯高于對照組，HCG日FSH值、血清和卵泡液中的Adropin水平明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 PCOS患者的Adropin水平及臨床參數(shù)

2.2取卵日PCOS患者Adropin水平 血清中Adropin水平明顯高于卵泡液中水平，差異有統(tǒng)計學意義。PCOS患者中Adropin水平顯明低于對照組中水平，差異有統(tǒng)計學意義。見圖1。

注：Ser為血清，F(xiàn)ol-F為卵泡液,Con為對照組。其中*表示P<0.001

圖1取卵日PCOS患者血清及卵泡液中Adropin水平

2.3PCOS患者IVF胚胎培養(yǎng)結果 PCOS組的獲卵數(shù)、正常受精數(shù)、正常卵裂數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)和可移植胚胎數(shù)顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；PCOS組卵子利用率低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；但優(yōu)質(zhì)胚胎率和正常受精率兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 PCOS患者IVF胚胎培養(yǎng)結果

注：卵子利用率=可移植胚胎數(shù)/獲卵數(shù)×100%；正常受精率=(D1出現(xiàn)2PN及2PB卵子數(shù))/IVF加精卵子總數(shù)或卵細胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(ICSI)注射MⅡ卵子總數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/卵裂數(shù)×100%[14]。

2.4PCOS患者Adropin水平與臨床參數(shù)及胚胎質(zhì)量的相關性分析 血清和卵泡液中Adropin水平與BMI、基礎LH值、LH/FSH值、空腹胰島素、獲卵數(shù)呈負相關性(P<0.05)，但與基礎E2值、基礎及HCG日FSH值呈正相關性(P<0.05)；此外，血清Adropin水平與胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、HCG日E2值、多PN受精率呈負相關性(P<0.05)，但與正常受精率呈正相關性(P<0.05)。見表3。

表3 PCOS患者Adropin水平與臨床參數(shù)及胚胎質(zhì)量的相關性分析(ng/mL)

續(xù)表3 PCOS患者Adropin水平與臨床參數(shù)及胚胎質(zhì)量的相關性分析(ng/mL)

注：HOMA-IR=Glu×INS/22.5；卵子利用率=可移植胚胎數(shù)/獲卵數(shù)×100%；正常受精率=(D1出現(xiàn)2PN及2PB卵子數(shù))/IVF加精卵子總數(shù)或ICSI注射MⅡ卵子總數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/卵裂數(shù)×100%[14]

3 討 論

Adropin參與人體能量代謝、調(diào)節(jié)脂類的生成、維持體內(nèi)葡萄糖的平衡并增加胰島素的靈敏度，但其機制仍不十分明確[15]，在預測輔助生殖治療結局中的作用也尚無定論。PCOS是育齡女性常見的婦科內(nèi)分泌疾病，是引起無排卵性不孕癥的主要原因，本研究的主要目的是探討血清和卵泡液中的Adropin水平對PCOS患者在輔助生殖治療中胚胎發(fā)育的預測價值。

PCOS患者的促排卵方案調(diào)節(jié)了Gn使用劑量，但由于PCOS患者竇卵泡數(shù)較多，最終獲卵數(shù)也顯著高于對照組，該基數(shù)的增多提高了PCOS組正常受精數(shù)、正常卵裂數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)和可移植胚胎數(shù)。本研究顯示PCOS患者的卵子利用率低于對照組，這與PCOS患者體內(nèi)的高LH水平和低FSH水平有關，過量分泌的LH與低于正常量的FSH易造成卵泡閉鎖并過早黃體化，導致卵泡發(fā)育不良和排卵障礙，卵母細胞的成熟度下降直接對卵子利用率產(chǎn)生不良影響，卵子利用率低下會降低胚胎的正常受精、優(yōu)質(zhì)胚胎和囊胚形成的比例，在獲卵數(shù)相近的情況下，PCOS患者每周期最終獲得可用胚胎的數(shù)量減少，同時也減少了移植和妊娠的機會。

在本研究中，兩組患者卵泡液中Adropin的表達均低于血清水平，與BOUSMPOULA等[16]的研究結果一致。Adropin主要合成于人類肝臟、腦組織等一些外周組織，又經(jīng)血清-卵泡屏障過濾，導致卵泡液中Adropin濃度較低。與對照組相比，PCOS患者血清和卵泡液Adropin水平顯著降低，與部分研究結果一致[16-18]。PCOS患者存在肥胖、葡萄糖耐量受損、胰島素抵抗等代謝紊亂現(xiàn)象，Adropin通過激活葡萄糖氧化的限速酶-丙酮酸脫氫酶，能夠提高細胞膜的葡萄糖轉運蛋白4的表達，同時下調(diào)對丙酮酸脫氫酶有抑制作用的丙酮酸脫氫酶激酶4，促進胰島素誘導PI3K/PKB的磷酸化，從而提高機體對胰島素的敏感度，降低IR導致的卵泡發(fā)育停滯、月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)的情況，提高患者的生育力。本研究顯示Adropin水平與HOMA-IR的呈負相關性，提示Adropin對PCOS患者卵母細胞的發(fā)育潛能具有正面的作用，推測高Adropin水平可能改善胚胎質(zhì)量與不孕癥治療效果。

血清Adropin水平與BMI的相關性目前存在爭議，本研究顯示PCOS患者血清和卵泡液Adropin水平與BMI呈負相關性，與其他報道結果一致[10,19]，另有一些研究者發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關性[16,20]或無相關性[21]。

本研究另一結果表明，血清Adropin水平與PCOS患者正常受精率呈正相關性，與多PN受精率呈負相關性。多PN受精又稱為多精受精，其原因主要是受精時有兩個或兩個以上的精子穿入卵子，體外授精后16～20 h可觀察到受精卵含有大于或等于3個原核(多見3PN)，是異常受精的類型之一。多PN的受精卵普遍不能正常發(fā)育，胚胎易早期死亡，通常棄去不用于移植。有研究證實，PCOS患者的ART不良結局在胚胎培養(yǎng)方面表現(xiàn)為受精率下降[22]，主要原因與卵母細胞質(zhì)量低下及胚胎發(fā)育潛能不足有關。如果胚胎受精率異常，應首先分析卵子成熟度是否有異常。Adropin作為能量調(diào)節(jié)因子，參與PCOS病情的發(fā)生發(fā)展，低Adropin表達加重患者的能量代謝紊亂，從而引起的卵母細胞抗氧化應激能力低下和線粒體功能障礙，影響了卵母細胞成熟所需的細胞質(zhì)的儲備、受精中卵母細胞的激活和胚胎的早期正常發(fā)育。ICSI注射前通過剝除顆粒細胞可以直接觀察到卵子的第一極體的排出情況(MⅡ率)，作為評估卵子成熟度的指標之一，用于預測ICSI正常受精率[23]。但IVF無法提前預知MⅡ率，大大降低了預測IVF正常受精率的效果。而PCOS患者血清Adropin水平的降低，提示了IVF方式下，患者的正常受精率可能下降，多PN受精率可能增高，導致可利用胚胎數(shù)減少，ART結局差。另有研究者報道，ICSI周期的3PN率為5.0%，遠低于IVF周期的33.9%[24]。因此，對于低Adropin水平的不孕癥患者，胚胎實驗室可以改變授精方式，實行ICSI受精，以確保正常受精卵母細胞的比例，最大限度實現(xiàn)對卵母細胞的利用。

鑒于本研究的患者僅限于首次行IVF治療的患者且數(shù)據(jù)數(shù)量有限，后期還需進一步擴大樣本量，并增加PCOS患者治療前后Adropin水平變化及相應的IVF結局情況，以進一步證實此結論。此外，今后還應當對患者的移植妊娠結局及新生兒情況進行隨訪，以進一步分析研究Adropin對IVF-ET結局的預測價值。

4 結 論

血清Adropin水平與PCOS患者的卵母細胞發(fā)育及受精情況存在一定相關性，對預測患者胚胎質(zhì)量、選擇授精方式具有參考意義，提示胚胎實驗室進行早期干預以提高患者可用胚胎的數(shù)量與質(zhì)量。