高敏化學發光法檢測血清梅毒特異性抗體臨床應用價值

楊衛華，王文惠，楊樂園，楊振華

(上海市寶山區中西醫結合醫院檢驗科,上海 201999)

梅毒是由梅毒螺旋體引起的慢性、系統性性傳播疾病。主要通過性途徑傳播，感染后可導致全身多器官損害[1]。由于梅毒的病程進展緩慢，常出現長時間的潛伏感染，并且顯性和隱性感染患者都具有傳染性，故梅毒的發生率在我國一直呈上升趨勢。近20年來，梅毒疫情一直是我國乃至世界范圍的嚴重公共問題[2]。

在梅毒防控和治療中，性能優越的梅毒檢測方法至關重要[3]。梅毒螺旋體明膠凝集試驗(TPPA)是一種具有很高的靈敏度和特異度的檢測方法，也是目前公認常用的梅毒抗體檢測的確證方法，但由于檢測時間較長、步驟繁瑣，不適宜實驗室大批量標本的檢測。且采用主觀的人眼判斷實驗結果，對于一些弱陽性樣本可能發生漏報，某些強陽性樣本則可能由于“HOOK”效應而出現假陰性結果。為了提高檢測效率和準確性，目前越來越多的實驗室采用化學發光法進行梅毒特異性抗體的檢查，其中高敏化學發光法(HISCL)是新的梅毒螺旋體抗原血清試驗方法，該方法不僅提高了檢測自動化程度，同時大大縮短了檢測時間[4]。

本研究應用HISCL和TPPA對5 568例血清標本進行梅毒螺旋體特異性抗體檢測，對于陽性和不一致的檢測結果采用蛋白質免疫印跡法(Western blot)進行確證試驗[5]。

1 資料與方法

1.1一般資料 5 568例血清標本來自于2017年12月至2018年6月本院門診及住院患者，其中男2 270例，女3 298例。<1歲18例，1～18歲895例，>18～60歲3 876例，>60歲779例。本研究經本院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 HISCL 5000全自動免疫分析儀及其配套的梅毒螺旋體抗體試劑盒(日本希森美康醫用電子有限公司)；TPPA試劑盒(日本富士必歐株式會社)；抗梅毒螺旋體抗體IgG免疫印跡試劑盒(德國歐蒙醫學診斷股份公司)；梅毒螺旋體室內質控品(上海市臨床檢驗中心提供，濃度為8 NCU/mL)。

1.3方法 所有血清標本分別用HISCL和TPPA進行檢測，實驗前操作人員掌握檢測方法、實驗方案和質量控制方法。所有操作嚴格按照試劑說明書以及《全國臨床檢驗操作規程》[6]進行。

檢測樣本的同時檢測室內質控品及陰、陽性對照，確保室內質控在控，以保證檢測質量。兩種方法試劑盒陰、陽性對照應符合預期；且外部室內質控檢測結果符合預期，TPPA外部陽性質控結果允許靶值上下一個滴度內，HISCL外部陽性質控結果應符合22S和13S規則。

HISCL檢測結果采用臨界值指數(COI)表示。COI為樣本發光強度和臨界值發光強度之比。COI 不足1.0的樣本，判定為陰性；COI在1.0及以上的樣本，判定為陽性。

TPPA檢測結果用陰陽性表示，非致敏顆粒檢測結果為陰性、致敏顆粒檢測結果為陽性，標本檢測孔肉眼可見U型板底均勻、散在顆粒，且滴度大于或等于1∶80即為陽性結果；否則即為陰性結果。

WB檢測結果時，印跡膜條上出現1條以上，相對分子質量為47 000、45 000、17 000或15 000的特異度條帶時，結果判為陽性；當僅出現1條特異度條帶即為臨界陽性，判為可疑；無特異度條帶出現則為陰性。TPPA和WB檢測結果均由兩位以上實驗操作人員進行獨立復核確認。

1.4統計學處理 采用SPSS22.0軟件，方法一致性采用Kappa檢驗[7]，一致性判斷標準：弱(Kappa≤0)，輕(0

2 結 果

2.1HISCL和TP檢測結果 5 568例血清標本中，HISCL和TPPA的均各檢出陽性標本201例，陰性標本5 367例，陽性檢出率均為3.61%。見表1。

表1 HISCL和TPPA符合率實驗表[3](n)

由表中計算得陽性符合率=201/(201+0)×100%=100%；陰性符合率=5 367/(5 367+0)×100%=100%，即本研究中HISCL和TPPA的符合率為100%，結果一致性等級達到最強(kappa=1.0)。靈敏度可達100%，特異度達99.70%，陽性預測值為92.04%，陰性預測值為100%。

2.2結果不符及陽性樣本進行免疫印跡法檢測結果 201例陽性血清標本中，經Western blot驗證，共計確認陽性標本185例，陰性標本10例，可疑標本6例。此6例可疑標本經臨床隨訪確認排除梅毒螺旋體感染。見表2。

表2 HISCL檢測性能表[3](n)

3 討 論

血清學檢測是診斷梅毒的重要依據，敏感度高和特異度好的檢測方法對梅毒診治至關重要[8]。據文獻報導，上海市近年來Ⅰ、Ⅱ期梅毒發病有所趨緩，隱性梅毒發病逐漸升高[9]。然而，目前普遍采用RPR和TRUST進行梅毒的初篩，TPPA進行梅毒確診的檢查方案，該方案對于潛伏期梅毒和神經性梅毒會造成一定的漏檢，不僅延誤臨床的治療，更容易導致性病的進一步傳播。

本實驗室應用HISCL和TPPA檢測了2017年11月至2018年6月的5 568例血清樣本，經統計分析HISCL與TPPA的符合率為100%。

應用Western blot對檢出的201例陽性標本進行驗證，HISCL與Western blot法檢測結果相比較出現的16例不符合中，COI值均在4.0以下。HISCL檢出陽性而Western blot確認為陰性的10例樣本中，主要為60歲以上的老年人、孕婦和1歲以下兒童。有文獻報告，老年患者隨著年齡的增高，梅毒抗體的假陽性率也呈上升趨勢，且年齡越高假陽性率越高，陽性率隨年齡增大呈階梯性升高[10-13]。導致老年患者梅毒抗體檢測生物學假陽性的因素有許多，主要包括癌癥、溶栓劑或抗凝劑治療、糖尿病、肝硬化、肝炎、腎病、自身免疫病、嚴重感染、代謝紊亂、手術等[14-15]。而且在實際診療過程中老年患者經常伴隨不止一個以上原因。而1歲以下兒童由于自身免疫系統尚未完全建立，因此不能單以實驗室檢測結果判斷是否感染梅毒，應結合流行病學調查加以判定。據文獻報告[16]：孕婦樣本中有較高比例的抗TP抗體假陽性，可能是其體內免疫、血脂及內分泌環境等因素改變引起的干擾所致。Western blot確認可疑的6例樣本經均為非陰性結果，即出現了1條特異度條帶，可能為梅毒早期感染或抗原較差反應，需臨床跟蹤隨訪。按ALTER等[17]在美國疾病預防控制中心擬定的“抗HCV的實驗室檢測和結果報告指南”中對Western blot確證試驗“不確定”結果的解釋，在排除檢測對象處于血清轉換過程的前提下，在低感染率人群中，Western blot“不確定”結果提示篩查試驗的結果為假陽性。6個可疑樣本經臨床流行病學調查結合隨訪，確認為非梅毒螺旋體感染。

TPPA因存在手工倍比稀釋、價格昂貴、檢測時間長、操作人員要求較高、主觀判讀結果等不足限制了使用范圍[15]。在檢測原理上，與傳統的TPPA采用“一步法”不同，HISCL采用兩步法檢測梅毒特異性抗體，在方法學上可以盡可能避免“HOOK”效應的產生，且自動化程度高，檢測速度快，以COI值進行結果判斷更客觀簡便，適宜進行大批量梅毒樣本的檢測。

4 結 論

HISCL法檢測梅毒特異性抗體結果與TPPA有很高一致性，且能實現自動化、高通量以及節省勞動力成本，可用于大規模梅毒初篩試驗。在實際應用中，應注意COI值4.0以下的弱陽性結果，而對老年人、腫瘤患者等梅毒抗體陽性報告無法確認，必要時應與臨床溝通，結合病史、臨床癥狀并進行WB確認實驗，以期為臨床提供更準確判斷依據。