類風濕性關節炎患者淋巴細胞和Treg/Th17平衡的檢測及意義

李智偉，田永芳，盧佩佩，劉小雙，岳曉媚，王昌敏△

(1.新疆維吾爾自治區人民醫院臨床檢驗中心，新疆烏魯木齊 830001；2.新疆醫科大學基礎醫學院，新疆烏魯木齊 830011)

類風濕性關節炎(RA)是以關節腫痛，滑膜關節破壞為特征的一種自身免疫性疾病。該病女性多發，年齡分布廣泛，致殘率較高[1]。目前其發病原因尚不完全清楚，研究報道淋巴細胞在疾病的發病和進展中均發揮重要作用[2]。淋巴細胞包括T、B、NK細胞，T細胞又分為輔助性T細胞(CD4+)和細胞毒T細胞(CD8+)。CD4+T在一定條件下可分化成輔助性T細胞1(Th1)、Th2、Th17、調節性T細胞(Treg)等不同亞型，進而調控免疫應答。Th17細胞介導炎性反應，Treg細胞介導免疫抑制，兩者的分化過程和功能相互拮抗。Th17/Treg失衡可導致機體的損害。本文通過分析RA患者和健康人群的T、B、NK細胞的分布及Treg和Th17細胞在RA患者中的平衡變化，探討Th17/Treg平衡與RA疾病之間的關系，為臨床免疫治療提供一定的理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年6-12月新疆維吾爾自治區人民醫院住院的RA患者65例為RA組，其中男18例，女47例；年齡37～74歲，平均(55.6±10.1)歲；漢族36例，其他民族29例。RA組納入標準：符合美國風濕病學會與歐洲風濕病防治聯合會2010年制定的RA診斷標準[3]。排除標準：排除患有腫瘤、其他自身免疫病和感染疾病的者。選擇67例體檢健康者作為健康對照組，其中男20例，女47例；平均(52.5±11.3)歲。經統計分析各組性別、年齡、民族差異均無統計學意義(P>0.05)。所有研究對象均都被告知標本采集的目的并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 FACSCantoⅡ流式細胞儀(美國BD公司)；試劑：Multitest IMK Kit(340503)；CD3-FITC(555339)；CD3-PerCP(552851);CD4-FITC(555346)；CD4-PE(555347)；IL-17A-PerCP(560666)；CD127-PE(561028)；CD25-APC(555434)；IgG1-PE(555749)、IgG1-APC(550854)、BD Cytometer Setup&Tracking Beads Kit(641319)以及溶血素(349202)、破膜劑(641776)、Trucount絕對計數管(340334)和Falcon流式進樣管均購自美國BD公司。

1.3方法

1.3.1標本采集 所有研究對象均于清晨空腹采集全血2 mL，使用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，標本于室溫保存，當日完成上機檢測。

1.3.2流式細胞儀檢測T、B、NK淋巴細胞 使用兩個Trucount的計數管，一管加入50 μL全血和20 μL Multitest IMK Kit A試劑(CD3/CD8/CD45/CD4)，第二管加入50 μL全血和20 μL Multitest IMK Kit B試劑(CD3/CD16+56/CD45/CD19)。震蕩混勻避光放置15 min后加入450 μL溶血素，放置15 min后上機。每次檢測前使用BD Cytometer Setup&Tracking Beads Kit進行質控，必要時調整機器電壓和補償。結果使用BD Canto軟件進行自動檢測分析。

1.3.3流式細胞儀檢測Treg和Th17細胞 Treg細胞設置兩管，一管試驗管，加入CD4-FITC、CD3-PerCP、CD25-APC、CD127-PE，另一管對照管加入CD4-FITC、CD3-PerCP、IgG1-PE、IgG1-APC。孵育15 min后加入溶血素2 mL，10 min后離心洗滌上機；Th17細胞也設置兩管，均先加入CD4-PE、CD3-FITC，孵育10 min后加入破膜劑A液再孵育5 min，加入溶血素10 min后離心棄上清后加入破膜劑B液，兩管再分別加入IL-17A-PE和IgG1-PE，孵育15 min后洗滌離心棄上清后上機檢測。全部試劑均加入試劑說明書推薦的劑量。每次檢測前使用BD Cytometer Setup&Tracking Beads Kit進行質控，必要時調整機器電壓和補償。使用BD DIVA軟件進行分析，以CD3和CD4設門，CD127low和CD25+細胞為Treg細胞；IL-17A+細胞為Th17細胞。

2 結 果

2.1T、B、NK細胞分析 從比例來看，與健康對照組相比，RA組的CD4比例明顯增高，差異有統計意義(P<0.01)；CD8比例明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)；CD4/CD8比值顯著增高，差異有統計學意義(P<0.01)。B細胞和NK細胞構成無明顯變化。見表1。

從絕對計數來看，RA組的T、B、NK細胞數量均比健康對照組低，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表1 RA組與健康對照組淋巴細胞亞群構成結果比較

表2 RA患者組與健康對照組淋巴細胞亞群絕對計數結果比較(個

表3 RA組與健康對照組Treg和Th17結果比較

注：A圖CD127lowCD25+為Treg細胞，B圖CD4+IL-17+為Th17細胞

圖1Treg和Th17流式細胞圖

2.2Treg和Th17細胞分析 RA組患者的Treg細胞較健康對照組有所下降，差異有統計學意義(P<0.05)；Th17細胞較健康對照組明顯上升，差異有統計學意義(P<0.01)。見表3和圖1。

3 討 論

RA是一種自身免疫性疾病，RA的發病機制與免疫系統密切相關[4]。各類淋巴細胞通過相互作用來維持機體正常的免疫平衡，T淋巴細胞介導細胞免疫，輔助性T細胞根據機體免疫狀況可以進一步分化成各類Th亞型細胞，并分泌不同的細胞因子來調節免疫系統，細胞毒T細胞(Ts)能夠特異型殺傷靶細胞[5-6]。在本研究中，RA組的CD4比例高于健康對照組，CD8比例低于健康對照組，CD4/CD8比值高于健康對照組，B細胞和NK細胞比例無明顯變化，與之前的研究相似[7-8]。從絕對計數方面比較來看，T、B、NK細胞數量整體低于健康對照組。RA患者患病時，機體的免疫平衡已被打破，由于疾病的免疫應答改變造成CD8的下降較CD4更為顯著，在RA發病后CD4被誘導分化成各亞型的能力也發生變化。Treg和Th17是近年來發現的在自身免疫性疾病中發揮重要作用的Th亞型[9-10]。Th17細胞通過分泌IL-17、IL-21和IL-23等細胞因子發揮免疫功能[11]，IL-17是強大的促炎癥因子，IL-17增多可以放大免疫級聯反應，進一步加重機體的炎性反應[12]。Treg細胞是負相免疫調節細胞，Treg可以釋放IL-10、TGF-β等細胞因子發揮抑制作用，進而避免機體產生過度的免疫反應[13-14]。在本研究中發現RA患者Treg顯著低于健康對照組，Th17顯著高于健康對照組，說明在RA患者體內平衡向促炎方向傾斜。健康者的免疫系統與骨骼系統之間是依靠緊密的相互作用來維持機體平衡的，RA是平衡出現紊亂的結果，活化的T細胞導致破骨細胞激活并產生骨侵蝕。有報道證實，Th17細胞通過上調滑膜成纖維細胞上的RANKL以及誘導局部炎性反應的方式，破壞關節炎中的骨組織[15]。在RA發病時Treg數量和功能也均產生異常，治療后Treg和Th17的平衡則會恢復到健康者的水平[16-17]，這些報道也證明了Treg和Th17的平衡的改變與RA疾病有一定的相關性。由于試驗條件有限，本研究并未進一步對Treg和Th17的相關細胞因子進行檢測。但是深入了解細胞亞群和細胞因子的網絡調節對揭示RA的發病機制很有幫助[18-19]。目前已有報道嘗試使用抗腫瘤壞死因子-α(TNF-α)對RA進行治療[20]，相信通過對淋巴細胞亞群及細胞因子進一步研究，能夠找到很好的RA免疫治療的靶點，為該病診斷和治療提供幫助。

綜上所述，本研究結果顯示,RA患者會出現淋巴細胞亞群比例改變和Treg/Th17 比例失衡的免疫現象，說明淋巴細胞各個亞群均可能參與了RA發生和發展。 Treg/Th17平衡也與RA疾病相關，在抑制炎性反應過度和疾病進展加重中發揮重要的調節作用。未來可以進一步深入研究以尋找潛在的免疫治療靶點。