人類表皮生長因子受體2和拓撲異構酶Ⅱα在結腸癌中的表達及意義

王月華 蔣林哲 鞠曉紅 李強 李瑤 鐘秀宏

(1吉林醫藥學院檢驗學院病原技術教研室，吉林 吉林 132013；2吉林市人民醫院普通外科；3吉林醫藥學院基礎醫學院病理教研室)

結腸癌是人類最為常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率逐年攀升〔1〕，近年來已躍升為我國消化道第二大惡性腫瘤。因結腸癌缺乏早期特征性表現，常發展至中晚期才被發現，導致預后不佳，而早發現早治療是改善其預后的重要因素。因此，尋找新的可用于早期診斷和判斷預后的生物學標志物,成為結腸癌當前的研究熱點。研究表明，人類表皮生長因子受體(HER)2和拓樸異構酶(TOPO)Ⅱα擴增和過度表達參與了多種腫瘤發生及轉化〔2～5〕。目前國內關于結腸癌患者HER2和TOPOⅡα研究報道不盡相同，且多采用免疫組化法檢測，而血清中此兩種蛋白表達水平研究鮮見報道。本文旨在探討結腸癌患者血清HER2和TOPOⅡα含量與結腸癌發生的關系。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取吉林市人民醫院普外科2017年6月至2018 年3月行手術切除的結腸癌患者45例作為結腸癌組，男26例，女19例，年齡60～75歲，平均(67.13±4.429)歲。正常組織對照取自結腸外傷手術組織12例為健康對照組1，男、女各6例，年齡60～69歲，平均(64.42±2.937)歲。正常血清對照為本院體檢中心進行體檢的健康人員45例為健康對照組2，男31例，女14例，年齡60～75歲，平均(66.33±4.178)歲。3組性別構成、年齡差異不顯著(P>0.05)。

1.2標本收集 術前于清晨空腹，經受試者肘靜脈采血3 ml，置于干燥無抗凝劑的試管中。室溫靜置0.5～1.0 h后，3 000 r/min離心5 min，取血清置于EP 管，存放于-80℃冰箱中備用；同時選取對應患者的結腸癌組織標本和健康對照組1組織標本，患者術前未經抗腫瘤治療，術后均經病理確診，病例均未同時患有其他惡性腫瘤，樣本均立即置10%甲醛液內固定。

1.3實驗方法 采用雙抗體夾心法定量檢測血清中HER2和TOPOⅡα的含量，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自鼎國試劑公司，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，于反應結束后，450 nm波長，空白對照孔調零后測各孔OD值，得出OD值繪制標準曲線，算出相應的水平值。對結腸癌組織和正常結腸組織分別行MaxVision免疫組織化學方法定性檢測HER2和TOPOⅡα的表達。HER2和TOPOⅡα的陽性染色表達均為大小不一的黃色或棕黃色顆粒，綜合考慮切片中陽性細胞占所觀察同類細胞的百分比和陽性細胞著色強度兩項指標來判定結果。根據染色評分+陽性細胞比評分=總分數,隨機選擇10個高倍視野(×400),根據標本顯色程度判斷陽性強度:無色為0分;淡黃色為1分;棕黃色為2分;棕黑色為3分;根據陽性細胞占觀察細胞的比例分為:陽性細胞數≤10%為1分；11%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。兩項分數之和:<2分為陰性(-)；2～3分為弱陽性(+)；4～5分為中度陽性()；6～7分為強陽性()。

1.4數據處理 采用SPSS20.0軟件進行t、χ2檢驗和Spearman等級相關分析法應用于相關性分析。

2 結 果

2.1HER2和TOPOⅡα在結腸癌組和健康對照組1組織中的表達 結腸癌組HER2主要表達于細胞膜，而TOPOⅡα主要見于細胞核。見圖1。結腸癌組HER2和TOPOⅡα陽性表達率分別為〔17例(37.8%)〕和〔26例(57.8%)〕；健康對照組1未見HER2和TOPOⅡα表達。 結腸癌組HER2和TOPOⅡα表達陽性率明顯高于健康對照組1(P<0.05)。

圖1 結腸癌組組織中HER2和TOPOⅡα表達(免疫組織化學染色，×400)

2.2兩組HER2和TOPOⅡα血清表達 結腸癌組血清HER2和TOPOⅡα水平均明顯高于健康對照組2(P<0.05)，見表1。

表1 兩組HER2和TOPOⅡα血清中表達

與結腸癌組比較：1)P<0.05

2.3HER2和TOPOⅡα在癌組織表達相關性 結腸癌組織中26例TOPOⅡα表達陽性中有15例HER2表達陽性；19 例TOPOⅡα表達陰性的結腸癌組織中17例HER2亦表達陰性；HER2和TOPOⅡα表達呈正相關(r=0.480,P<0.05)。

2.4HER2和TOPOⅡα在結腸癌血清中表達相關性 結腸癌組血清中HER2和TOPOⅡα表達正相關(r=0.610,P<0.05)。

3 討 論

HER2蛋白是原癌基因HER2/neu(17q12-21)〔6〕編碼的具有受體酪氨酸激酶活性的185 kD跨膜糖蛋白，屬于表皮生長因子受體家族的一員。HER2由胞外氨基末端配體結合域、單鏈跨膜區域及具有酪氨酸激酶活性的細胞內區域構成，存在于細胞表面的胞外段受蛋白酶裂解脫落釋放進入血液即血清HER2(sp185)蛋白。本研究結果提示：HER2參與了結腸癌的發生，且在組織和血清中均高表達。HER2主要表達于胚胎時期，成年后一般只出現在少數正常組織中。當HER2表達上調，可被相應的配體激活影響下游信號轉導途徑，如通過蛋白激酶(Akt)通路抑制細胞凋亡，促進腫瘤細胞存活；通過Ras/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑影響腫瘤細胞的增殖、分化〔7〕。故出現擴增和過表達，可能提示腫瘤的發生〔8〕。

TopoⅡα是真核細胞內的一種重要核酶，是DNA拓撲異構酶的一種〔9〕。因其能夠催化DNA鏈的斷裂與結合，調控DNA的拓撲狀態，參與基因的復制、轉錄、翻譯等過程中DNA 空間結構和生理功能調節，故與細胞增殖和凋亡密切相關。本研究結果提示，TopoⅡα可能參與了結腸癌的發生，且在組織和血清中均高表達。TopoⅡα通過催化切斷DNA鏈的磷酸二酯鍵，產生DNA缺口而發揮作用，這種缺口可以改變DNA分子的拓撲結構，從而解決DNA纏結狀態這一問題。TopoⅡα表達降低，將阻止DNA快速修復，斷裂的DNA雙鏈積累將激活DNA損傷反應，導致G1、S和(或)G2阻滯，誘導細胞凋亡〔10〕。研究顯示TopoⅡα多表達于增殖細胞內，而且在快速增殖細胞中的表達水平是靜止細胞的數倍，主要表達于S 期、G2期及 M 期細胞，高表達時提示腫瘤復制加快,增加腫瘤的惡性程度〔6〕。故TopoⅡα過表達可能提示腫瘤的發生〔11〕。

本研究顯示，HER2和TopoⅡα在結腸癌組織和血清中表達呈正相關。由于HER2基因與TopoⅡα基因均定位于17q12～q21染色體上，所以兩種基因的擴增或缺失可能具有協同效應。當HER2表達增高，可激活PI3K和Ras/MAPK等信號通路，調節下游靶基因，間接促進TopoⅡα表達上調，這在分子水平上為二者在結腸癌中表達相關性提供了一定的理論依據。血清檢測是一個非侵入性并可量化的檢測方式，利于早期篩查，故聯合檢測二者在結腸癌組織和血清中的表達，為了解HER2和TopoⅡα與結腸癌發生發展關系提供了一定的實驗基礎〔12〕。為確保HER2和TOPOⅡα作為結腸癌診斷標志物的可靠性，還需要進行更多樣本的研究，以確立二者對結腸癌的診斷價值。