Aurora-A、Aurora-B和Cath-D在肝細胞癌中的表達

郭海州 安生花 林明哲 李進章 周毛 祁艷娟

(青海大學附屬醫院 1寧養院，青海 西寧 810001；2腫瘤內科；3腫瘤放療科)

肝細胞癌起源于肝細胞，發生于硬化性的肝組織內。肝炎病毒、酒精、代謝性疾病、藥物等是腫瘤發生的重要危險因素〔1〕。病變發生時可以觀察到相關基因和蛋白的表達失調〔2〕。Aurora激酶(Aurora)-A、Aurora-B是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，能對細胞的有絲分裂和增殖起重要作用，近年認為二者的作用可能更多，如對轉移的促進作用等〔3,4〕。組織蛋白酶(Cath)-D是機體中的水解酶，可以對細胞外基質成分進行降解，對細胞的遷移提供支持作用〔5〕。本研究應用免疫組化和熒光PCR技術檢測肝細胞癌中Aurora-A、Aurora-B和Cath-D表達特征，并進行對照觀察，關注蛋白之間的相關性及對判斷預后的價值。

1 資料和方法

1.1臨床資料 選擇2015年2月至2017年10月青海大學附屬醫院收治的肝細胞癌患者共65例作為觀察組1，納入標準：①均行手術治療，且經術后病理確診；②符合世界衛生組織(WHO)中肝細胞癌的診斷標準及分型。排除標準：①合并其他器官惡性腫瘤；②具有先天發育異常；③有消化系統手術史；④混合性癌。其中男35例，女30例，年齡46～89〔平均(60.9±9.2)〕歲。其中高-中分化42例，低分化23例。患者或家屬簽署知情同意書。選擇25例肝細胞腺瘤術后組織作為對照組1，男13例，女12例，年齡44～80〔平均(57.7±8.9)〕歲。選擇觀察組中距腫物邊緣大于3 cm的非腫瘤性的肝組織(正常肝組織)25例作為正常對照組1，男14例，女11例，年齡47～85〔平均(59.8±7.1)〕歲。選擇觀察組1中的新鮮腫瘤組織15例作為觀察組2，其中男8例，女7例，年齡44～79〔平均(61.2±7.8)〕歲。選擇對照組1中的新鮮肝細胞腺瘤組織15例作為對照組2，其中男8例，女7例，年齡47～78〔平均(59.8±7.5)〕歲。選擇正常對照組1中的新鮮正常肝組織15例作為對照組3，其中男8例，女7例，年齡48～75〔平均(58.8±6.9)〕歲。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2免疫組化方法檢測蛋白的表達 觀察組1、對照組1、正常對照組1術后均常規切取1.5×1.0 cm、厚2.0 mm的組織，應用中性甲醛進行固定12 h以上，脫水后并石蠟包埋，切4 μm的切片置于膠片上。Aurora-A、Aurora-B和Cath-D均購自蘇州睿贏生物公司。Aurora-A、Aurora-B和Cath-D的試劑均為濃縮液，先進行預實驗，并選擇Aurora-A為1∶300、Aurora-B為1∶250，Cath-D為1∶100顯色最理想的濃度用于正式實驗。三種蛋白的檢測均基于石蠟切片，正式實驗應用免疫組化SP法，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，均嚴格按照操作說明進行，均由同一名實驗師進行全程操作，做好質控工作(設陽性對照)。

1.3熒光PCR檢測mRNA的表達 應用熒光PCR技術檢測觀察組2、對照組2和正常對照組2中Aurora-A、Aurora-B和Cath-D的mRNA表達水平。GAPDH上游引物：5′-CTTTAGTATCTTGGAAGGACTC-3′,下游引物：5′-GTAGAGGCAGGGATGAGTCCT-3′，擴增長度149 bp；Aurora-A上游引物:5′-TGGAATATGCACCACTTGGA-3′，下游引物：5′-ACTGACCACCCAAAATCTGC-3′，擴增長度208 bp；Aurora-B上游引物：5′-GATGGTCCCTGTCATTCAC-TCGGGTGCGTGTGTTTGTATG-3′,下游引物：5′-TCTGTGTATGTATAGGG-3′，擴增長度105 bp；Cath-D上游引物：5′-TGGAACAGAAGACCACTCTCATCGAT-3′，下游引物：5′-GCAACGATCTTCGTCAAACATCGTA-3′，擴增長度76 bp。操作嚴格按實驗步驟完成，均由同一實驗師完成，并設陽性對照和陰性對照，做好質控工作。擴增程序：95℃ 10 min(1個循環)，95℃ 25 s(10個循環)，67℃ 20 s(10個循環)，95℃ 20 s(35個循環)。

1.4結果判定 免疫組化結果的判定：Aurora-A、Aurora-B和Cath-D的顯色部位均是細胞質，以染成棕黃色顆粒為陽性細胞。在顯微鏡下尋找染色明顯的上皮細胞分布區(熱點區)，共選擇5個視野(400倍)進行計數，以<10%為陰性，以≥10%為陽性。計算陽性率。

熒光PCR結果的判定：判定羥基熒光素(FAM)、甲基熒光素(VIC)、羥基X羅丹明鹽酸鹽(ROX)通道的循環閾(Ct)值為未確定的(Undet)或Ct值大于30的樣本為陰性，判定曲線為明顯的S型擴增曲線且Ct值小于等于30的樣本為陽性。

1.5統計學處理 應用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗、線性相關性分析和Kaplan-Meier生存分析。

2 結 果

2.13組Aurora-A、Aurora-B和Cath-D蛋白表達比較 觀察組1、對照組1和正常對照組1 Aurora-A、Aurora-B和Cath-D表達差別有統計學意義(均P<0.05)。正常對照組1蛋白表達陽性率且顯著低于對照組1，對照組1蛋白表達陽性率顯著低于觀察組1(均P<0.05)。見圖1、表1。

Aurora-A

Aurora-B

Cath-D圖1 Aurora-A、Aurora-B、Cath-D在肝細胞癌中陽性表達(DAB，×400)

表1 三組Aurora-A、Aurora-B和Cath-D陽性表達率比較〔n(%)〕

與正常對照組1比較：1)P<0.05;與對照組1比較：2)P<0.05

2.2觀察組1中Aurora-A、Aurora-B和Cath-D的表達陽性率在不同臨床病理特征中的比較 觀察組1中Aurora-A、Aurora-B和Cath-D的表達與脈管累犯和轉移顯著相關，Aurora-A、Aurora-B的表達與細胞增殖指數、最大徑和分化程度顯著相關(均P<0.05)。見表2。

表2 觀察組1中Aurora-A、 Aurora-B和Cath-D陽性率在不同臨床病理特征中的比較〔n(%)〕

2.3Aurora-A、Aurora-B和Cath-D mRNA表達陽性率比較 觀察組2 Aurora-A、Aurora-B和Cath-D mRNA表達的陽性率顯著高于對照組2和正常對照組2，對照組2顯著高于正常對照組2(均P<0.05)。見圖2、表3。

Aurora-A mRNA

Aurora-B mRNA

Cath-D mRNA1：陽性曲線；2：內控曲線圖2 Aurora-A、Aurora-B、Cath-D mRNA在肝細胞癌中陽性表達曲線

表3 三組Aurora-A、Aurora-B和Cath-D表達陽性率比較〔n(%),n=15〕

與正常對照組2比較：1)P<0.05;與對照組2比較：2)P<0.05

2.4觀察組1中Aurora-A、Aurora-B和Cath-D相關性分析 觀察組1中Aurora-A和Cath-D(r=0.41,P=0.012)、Aurora-B和Cath-D(r=0.44,P=0.031)呈顯著正相關。

2.5觀察組1中Aurora-A、Aurora-B和Cath-D表達的生存分析 觀察組1的隨訪生存時間3～60個月，平均20.5個月，經生存分析顯示Aurora-A(χ2=5.54,P=0.016 4)、Aurora-B(χ2=5.98,P=0.012 0)和Cath-D(χ2=4.75,P=0.025 1)的表達與生存時間顯著相關(P<0.05)。即Aurora-A、Aurora-B和Cath-D高表達患者生存時間短，預后差；Aurora-A、Aurora-B和Cath-D低表達患者生存時間長，預后好。見圖3～5。

圖3 Aurora-A的表達與預后的關系

圖4 Aurora-B的表達與預后的關系

圖5 Cath-D的表達與預后的關系

3 討 論

肝細胞癌發生時常伴有肝硬化的病史，術中觀察到有肝硬化的特點，其腫塊或結節常大小不一，腫瘤一般較軟，易出血及出現血管浸潤，邊界不規則，并可見衛星結節，顯微鏡下可見多種形態類型，包括梁狀型、腺泡型、假腺樣、實性型、硬化型，不同病變類型是病理醫師鑒別腫瘤的依據〔6〕。在病變形成過程中，轉移相關的蛋白及增殖相關蛋白表達多為異常，對促進病變形成和進展有一定意義。Aurora激酶家族是近年來研究較多的有絲分裂蛋白激酶，它開始于DNA復制，結束于胞質的分裂，有絲分裂的發生伴隨著細胞的一分為二，因此導致了細胞的分裂和各部分明顯的增殖特點〔7,8〕。在分裂過程中，兩極紡錘體的形成和分離、裝配、排列及分裂等步驟，均需要依賴于Aurora-A、Aurora-B的作用，因此二者在細胞的有絲分裂中有重要的調節作用。Aurora-A、Aurora-B對增殖和細胞分裂的調控主要是受細胞周期蛋白(Cyclin)-A和-B來實現的〔9〕。研究認為Aurora-A、Aurora-B含有兩種腺瘤樣息肉病基因(APC)識別信號，一種是CyclinB降解所必需的C末端同源盒基因，一種是類似于被APC泛素化的CDC20上的N末端盒基因，該位點對阻斷Aurora-A的上皮型黏附素(CDH)1依賴性破壞有一定作用〔10〕。Aurora-A可以通過誘導多種相關蛋白磷酸化來介導有絲分裂過程，即激活人參皂苷化學修飾物(PM)1和TPX2，這一過程會調節Aurora-A、Aurora-B介導磷酸化。也有觀點認為Aurora-A、Aurora-B可以參與染色質的修復，常通過磷酸化組蛋白(H2AX)參與染色質的重塑實現〔11〕。Aurora-B也被認為是過客蛋白，在分裂過程的前期和中期附在著絲粒上，后期附在微管上，此時Aurora-B能使組蛋白出現明顯的磷酸化，Aurora-B在細胞分裂的中期對調節染色體的分離有一定作用〔12〕。肝細胞癌是高遷移性腫瘤，其生長時易出現轉移，腫瘤細胞遷移與基質金屬蛋白酶(MMPs)的降解和基底膜屏障的損傷有關。Cath-D蛋白是一種溶酶體蛋白水解酶，在酸性環境中形成最多。人體組織中Cath-D的主要存在形式是34 kD的成熟穩定體〔13〕。其功能有：①作為調節腫瘤轉移的相關蛋白發揮作用；②作為增生的相關促進因子，主要是通過胰島素樣生長因子(IGF)-1調控；③作為蛋白水解酶發揮溶解基底膜和細胞外基質的作用〔14〕；④釋放基質破壞相關的蛋白，如MMP-2等；⑤激活Cath-B引起的級聯反應〔15〕。

本實驗結果顯示三組中Aurora-A、Aurora-B和Cath-D的蛋白和mRNA表達的陽性率的差別有統計學意義，提示三者是引起腫瘤形成的重要基因。Aurora-A、Aurora-B和Cath-D蛋白mRNA表達有明顯表達一致性。肝細胞癌發生的因素有階段性改變，三者也具有明確的癌基因樣的作用。結果顯示觀察組1中Aurora-A、Aurora-B和Cath-D的表達與脈管累犯和轉移相關，提示三者參與腫瘤的脈管浸潤和轉移過程，使腫瘤細胞遷移能力增強。Aurora-A、Aurora-B的表達與細胞增殖指數和最大徑有關，提示二者可以促進腫瘤的增殖和生長，使腫瘤的體積增大。觀察組1中Aurora-A、Aurora-B的表達與分化程度相關，提示二者可以調節腫瘤細胞由幼稚到成熟的過程，阻止腫瘤細胞分化成熟，使其停滯在幼稚的某個階段，細胞的異型程度明顯，細胞的形態差異大，失控性增生明顯。觀察組1中Aurora-A和Cath-D 、Aurora-B和Cath-D 的表達具有正相關性，提示Aurora-A、Aurora-B對轉移的作用可能是通過調節Cath-D實現的。Aurora-A、Aurora-B可能作為上游蛋白發揮作用，促進Cath-D分泌，產生蛋白水解和基質降解的作用。Aurora-A對P53等多個位點的絲氨酸可形成磷酸化，滅活P53，加速腫瘤的生長。Aurora-A、Aurora-B可能通過其他細胞因子等信號轉導系統發揮作用，促進腫瘤的增殖和進展。在肝細胞癌的發生和進展中，癌細胞通過基因擴增、剪接和選擇性啟動子激活等方式分泌較多的Cath-D，此時溶酶體易位到質膜或分泌到細胞外環境，使腫瘤細胞的微環境發生改變，腫瘤細胞與基質形成互相的調節作用〔16,17〕。Aurora-A、Aurora-B高表達后可以誘導Cath-D分泌增多，這時對間質中的相關成分進行溶解，也對降解細胞外基質和基底膜有一定作用，細胞遷移的屏障受到破壞，腫瘤細胞易于離開原發灶形成播散和種植〔18〕。