程序化細胞死亡因子5對腫瘤壞死因子-α誘導大鼠關節(jié)軟骨細胞損傷的影響

華植 韋嵩 陳志煌 李曉昊 張嫻嫻 侯春福 劉穎琬 李慧

(1解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 廣州 510010；2廣州中醫(yī)藥大學)

骨性關節(jié)炎又稱為肥大性關節(jié)炎、退行性關節(jié)炎等，是生物學因素或者力學因素刺激引起軟骨細胞、軟骨下骨、軟骨細胞外基質(zhì)的失衡，膝骨性關節(jié)炎患者以關節(jié)腫脹、功能障礙、關節(jié)僵硬等為臨床表現(xiàn)，嚴重者甚至表現(xiàn)為關節(jié)畸形等〔1,2〕。關節(jié)軟骨細胞損傷、凋亡增多是骨性關節(jié)炎發(fā)生的重要原因。程序化細胞死亡因子(PDCD)5是一種凋亡相關基因，在進化過程中高度保守，其可以促進腫瘤細胞等多種細胞的凋亡〔3,4〕。研究表明，PDCD5在關節(jié)炎軟骨組織中表達水平異常升高，可能參與軟骨細胞凋亡過程〔5,6〕。本實驗分離培養(yǎng)關節(jié)軟骨細胞，用腫瘤壞死因子(TNF)-α處理體外構建關節(jié)炎軟骨細胞模型，探討PDCD5對骨關節(jié)炎軟骨細胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1主要材料 SD大鼠購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心；SYBR Prime Script實時聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒購自大連Takara；Ⅱ型膠原酶購自美國Sigma；TNF-α購自武漢亞法生物技術公司；PDCD5 siRNA慢病毒、siRNA control慢病毒由吉滿生物科技(上海)有限公司構建；實驗所用引物均由上海生工合成；超氧化物歧化酶(SOD)活性測定試劑盒、一氧化氮(NO)合酶(NOS)活性測定試劑盒購自上海碧云天；PDCD5抗體購自天津saierbio；剪切型Caspase(Cleaved Caspase)-3、-9抗體購自美國CST。

1.2關節(jié)軟骨細胞分離培養(yǎng) 步驟同文獻〔7〕，取10只SD大鼠(清潔級，雌性各半)，脫頸處死以后，置于75%的乙醇中浸泡消毒5 min。在無菌條件下取出膝關節(jié)，轉(zhuǎn)移到平皿中，用生理鹽水將膝關節(jié)洗滌后，把周圍附著的肌肉、骨膜、肌肉等組織去除，將關節(jié)表面的軟骨用刀片削取下來，以磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，將軟骨剪碎成≤1 mm3的組織塊，轉(zhuǎn)移到錐形瓶內(nèi)。添加5 ml的0.2%的Ⅱ型膠原酶，放在37℃的水浴鍋中消化120 min。用200目尼龍網(wǎng)過濾以后，3 300 r/min離心5 min，收集細胞沉淀，加入10%胎牛血清的杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)。再用0.2%的Ⅱ型膠原酶消化2次上述組織塊，將收集的細胞混合，調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml，種植到25 cm2的細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，每個培養(yǎng)瓶內(nèi)加入5 ml的細胞懸浮液，培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2培養(yǎng)箱。細胞融合度為80%時，用0.25%的胰蛋白酶消化，制成細胞懸浮液，種植到培養(yǎng)皿中貼壁10 min，成纖維細胞貼壁速度高于關節(jié)軟骨細胞，收集沒有貼壁的細胞及培養(yǎng)液，種植到細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)。用阿里新藍染色法和Ⅱ型膠原免疫組化法鑒定分離的細胞為關節(jié)軟骨細胞。

1.3細胞分組處理 取第3代關節(jié)軟骨細胞，分為Control組、TNF-α組、siRNA control+TNF-α組、PDCD5 siRNA+TNF-α組，處理方法為：Control組，關節(jié)軟骨細胞不做任何處理；TNF-α組，在實驗0 h時，在細胞培養(yǎng)液中加入20 ng/ml的TNF-α；siRNA control+TNF-α組，實驗開始前關節(jié)軟骨細胞穩(wěn)定感染siRNA control慢病毒，在實驗0 h時，細胞培養(yǎng)液中加入20 ng/ml的TNF-α；PDCD5 siRNA+TNF-α組，實驗開始前關節(jié)軟骨細胞穩(wěn)定感染PDCD5 siRNA慢病毒，在實驗0 h時，在細胞培養(yǎng)液中加入20 ng/ml的TNF-α。各組細胞在培養(yǎng)24 h以后，做后續(xù)實驗檢測。慢病毒感染步驟如下：關節(jié)軟骨細胞在感染前1 d，以每個孔中加入2 000個細胞種植到96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h以后，對細胞進行換液，以感染復數(shù)(MO)=30加入病毒液，培養(yǎng)3 d以后，熒光顯微鏡下觀察細胞感染效率高于90%。首先用實時PCR和Western印跡方法測定Control組、TNF-α組細胞中PDCD5表達水平，再用同樣的方法測定TNF-α組、siRNA control+TNF-α組、PDCD5 siRNA+TNF-α組細胞中PDCD5表達水平。

1.4實時PCR測定細胞中PDCD5表達 收集細胞，用PBS將細胞洗滌以后，用TRIZOL法常規(guī)提取細胞中的總RNA，RNA溶解于焦碳酸二乙酯(DEPC)水中。吸取1 μg的RNA，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，引物為OligodT。以SYBR Prime Script實時PCR試劑盒對PDCD5基因進行定量，內(nèi)參為β-actin。β-actin引物序列，正義5'-AGAGGGAAATCGTGCGTG-3'，反義5'-CCATACCCAGGAAGGAAGGCT-3'。PDCD5引物序列，正義5'-GTGATGCGGCCCAACAG-3'，反義5'-ATCCAGAACTTGGGCTAAGATACTG-3'。

1.5Western印跡測定細胞中PDCD5表達 收集細胞，把培養(yǎng)液上清棄掉，添加放射免疫沉淀(RIPA)裂解液，放在冰上裂解20 min后，用細胞刮刀將細胞收集以后，12 000 r/min離心10 min，吸取上清溶液，保存至-80℃，同時留取10 μl的蛋白溶液用于聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量，具體步驟同試劑盒說明書。用12%的分離膠和5%的濃縮膠進行電泳，每個孔中加入40 μg的蛋白，濃縮膠中以80 V的電壓電泳，分離膠中用100 V電壓電泳。把聚偏氟乙烯(PVDF)膜放在無水乙醇中浸泡10 min以后，再轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15 min。轉(zhuǎn)膜電壓用100 V，轉(zhuǎn)膜置于冰上進行。取出PVDF膜后，浸泡于含有5%牛血清白蛋白的Tween-20 Tris-鹽酸溶液(TBST)中，于室溫條件下孵育2 h。再把PVDF膜依次與1∶600稀釋的PDCD5抗體、辣根過氧化物標記的二抗在室溫中孵育2 h以后，電化學發(fā)光(ECL)試劑盒發(fā)光，凝膠成像儀成像以后，分析目的蛋白灰度值同內(nèi)參β-actin灰度值的比值。

1.6噻唑藍(MTT)測定細胞增殖 將穩(wěn)定感染后的關節(jié)軟骨細胞種植到96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，按照上述分組方法處理細胞，孵育24 h以后，在每個孔中加入20 μl的MTT，繼續(xù)孵育4 h以后，把上清液吸除掉，加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)將結晶溶解，測定每個孔490 nm的A值。

1.7流式細胞術測定細胞凋亡 Control組、TNF-α組、siRNA control+TNF-α組、PDCD5 siRNA+TNF-α組細胞按照上述方法處理培養(yǎng)24 h以后，用0.25%的胰蛋白酶消化并收集細胞，用4℃的PBS將細胞懸浮以后，3 300 r/min離心10 min，將上清吸除。加入結合緩沖液，使每毫升的懸浮液中含有106個細胞，吸取100 μl的細胞懸液，轉(zhuǎn)移到流式管中，加入5 μl的碘化丙啶(PI)和Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)混勻以后，在室溫中孵育15 min，再添加400 μl的PBS，檢測凋亡情況。

1.8Western印跡測定細胞中Cleaved Caspase-3、-9蛋白水平 Control組、TNF-α組、siRNA control+TNF-α組、PDCD5 siRNA+TNF-α組細胞按照上述方法處理培養(yǎng)24 h以后，檢測各組細胞中Cleaved Caspase-3、-9蛋白水平，步驟同上。

1.9細胞中 SOD、NOS活性檢測 Control組、TNF-α組、siRNA control+TNF-α組、PDCD5 siRNA+TNF-α組細胞按照上述方法處理培養(yǎng)24 h以后，收集細胞，檢測細胞中SOD、NOS活性，步驟同試劑盒。

1.10統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗和單因素方差分析。

2 結 果

2.1TNF-α作用后關節(jié)軟骨細胞中PDCD5的表達 TNF-α組關節(jié)軟骨細胞中PDCD5 mRNA (2.14±0.21)和蛋白表達水平(0.65±0.06)顯著高于Control組(1.00±0.00、0.20±0.03)(P<0.05)。見圖1。TNF-α誘導關節(jié)軟骨細胞中PDCD5的表達。

圖1 Western印跡測定TNF-α對關節(jié)軟骨細胞中PDCD5表達的影響

2.2慢病毒感染下調(diào)TNF-α條件下關節(jié)軟骨細胞中PDCD5的表達 PDCD5 siRNA+TNF-α組關節(jié)軟骨細胞中PDCD5 mRNA(0.35±0.06)和蛋白表達水平(0.18±0.06)顯著低于TNF-α組(1.00±0.00、0.76±0.09)(P<0.05)。siRNA control+TNF-α組關節(jié)軟骨細胞中PDCD5 mRNA(0.98±0.14)和蛋白表達水平(0.78±0.10)與TNF-α組比較無明顯差異(P>0.05)。見圖2。

1～3:TNF-α組;siRNA control+TNF-α組;PDCD5 siRNA+TNF-α組圖2 Western印跡測定慢病毒感染后經(jīng)TNF-α誘導后關節(jié)軟骨細胞中PDCD4表達

2.3下調(diào)PDCD5提高TNF-α條件下關節(jié)軟骨細胞增殖能力 TNF-α組關節(jié)軟骨細胞A值(0.50±0.04)顯著低于Control組(0.75±0.06)(P<0.05)。PDCD5 siRNA+TNF-α組關節(jié)軟骨細胞A值(0.64±0.03)顯著高于TNF-α組(P<0.05)。siRNA control+TNF-α組關節(jié)軟骨細胞A值(0.49±0.06)與TNF-α組比較無明顯差異(P>0.05)。下調(diào)PDCD5可以逆轉(zhuǎn)TNF-α對骨關節(jié)軟骨細胞增殖抑制作用。

2.4下調(diào)PDCD5減少TNF-α條件下關節(jié)軟骨細胞凋亡 TNF-α組關節(jié)軟骨細胞凋亡率及Cleaved Caspase-3、-9蛋白水平顯著高于Control組(P<0.05)。PDCD5 siRNA+TNF-α組關節(jié)軟骨細胞凋亡率及Cleaved Caspase-3、-9蛋白水平顯著低于TNF-α組(P<0.05)。siRNA control+TNF-α組關節(jié)軟骨細胞凋亡率及Cleaved Caspase-3、-9蛋白水平與TNF-α組比較無明顯差異(P>0.05)。下調(diào)PDCD5可以逆轉(zhuǎn)TNF-α對骨關節(jié)軟骨細胞凋亡誘導作用。見圖3、表1和圖4。

2.5下調(diào)PDCD5對TNF-α處理后關節(jié)軟骨細胞中SOD、NOS水平影響 TNF-α組關節(jié)軟骨細胞SOD活性低于Control組，NOS活性高于Control組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PDCD5 siRNA+TNF-α組關節(jié)軟骨細胞SOD活性高于TNF-α組，NOS活性低于TNF-α組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。siRNA control+TNF-α組關節(jié)軟骨細胞SOD、NOS活性與TNF-α組比較無明顯差異(P>0.05)。見表1。下調(diào)PDCD5可以逆轉(zhuǎn)TNF-α對骨關節(jié)軟骨細胞中SOD、NOS活性影響。

圖3 流式細胞術測定各組關節(jié)軟骨細胞凋亡

表1 沉默PDCD5經(jīng)TNF-α處理的關節(jié)軟骨細胞凋亡及細胞中Cleaved Caspase-3、-9蛋白水平、SOD、NOS活性

與Control組比較：1)P<0.05；與TNF-α組比較：2)P<0.05

1～4:Control組;TNF-α組;siRNA control+TNF-α組;PDCD5 siRNA+TNF-α組圖4 Western印跡檢測關節(jié)軟骨細胞中Cleaved Caspase-3、-9蛋白水平

3 討 論

骨關節(jié)炎發(fā)病原因和機制尚未完全闡明，其中軟骨退變是發(fā)病的重要原因，也是啟動病理性骨性關節(jié)炎進程的因素之一，軟骨細胞和軟骨基質(zhì)共同構成了關節(jié)軟骨，在關節(jié)炎的早期，關節(jié)軟骨具有自我修復能力，而在關節(jié)炎后期，炎癥誘導的損傷逐漸表現(xiàn)出來〔8～10〕。研究表明，軟骨細胞的增殖可以抑制軟骨降解，而軟骨細胞凋亡在軟骨破壞中具有重要作用，其可以誘導關節(jié)軟骨退行性病理變化的發(fā)生〔11,12〕。正常狀態(tài)下的軟骨細胞凋亡是軟骨組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的基礎，其不僅可以維持軟骨形態(tài)，還參與軟骨組織功能發(fā)揮，當軟骨細胞凋亡水平超過一定的范疇之后，會引發(fā)軟骨細胞急劇減少，導致軟骨基質(zhì)減少，引起關節(jié)軟骨退變〔13〕。Caspase-9是Caspase凋亡反應的上游啟動因子，其活化后可以激活凋亡執(zhí)行因子Caspase-3的活化，誘導細胞凋亡發(fā)生〔14,15〕。本研究表明，TNF-α可以誘導關節(jié)軟骨細胞凋亡，抑制細胞增殖活性，同時可以上調(diào)細胞中Caspase-3、-9活化水平，提示TNF-α可以促進Caspase-3、-9介導的關節(jié)軟骨細胞凋亡，誘導關節(jié)軟骨細胞損傷。

正常軟骨細胞凋亡主要發(fā)生于表層，而關節(jié)炎患者移行層和輻射層軟骨細胞凋亡也明顯增多，在關節(jié)炎患者的關節(jié)滑液中發(fā)現(xiàn)NO含量升高，NO可以在體外誘導軟骨細胞凋亡〔16〕。有研究表明，關節(jié)炎發(fā)生時，炎性細胞因子可以誘導細胞內(nèi)NOS活性升高，合成大量NO，而過量NO能夠?qū)毎a(chǎn)生毒性作用〔17〕。除了NO合成水平與軟骨細胞凋亡有關之外，氧自由基過多也可以誘導軟骨細胞凋亡，SOD是氧自由基清除劑，其活性升高可以降低細胞內(nèi)氧自由基水平，減少細胞凋亡〔18,19〕。本實驗結果提示，TNF-α通過影響細胞內(nèi)抗氧化酶活性和NOS活性誘導細胞凋亡。

PDCD5基因編碼的蛋白含有一個帶電殘基，其含有6個外顯子和5個內(nèi)含子，其中外顯子6是促進細胞凋亡的活性功能結構域，其在多種組織和細胞中均有表達，參與腫瘤、關節(jié)炎、多囊卵巢綜合征、腎炎等疾病的發(fā)生，PDCD5表達水平升高可以通過Caspase級聯(lián)反應誘導細胞凋亡〔5，20～23〕。PDCD5參與類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞凋亡過程，在關節(jié)炎軟骨組織中高表達〔24,25〕。本實驗結果表明，TNF-α誘導關節(jié)軟骨細胞中PDCD5的表達，沉默PDCD5可以逆轉(zhuǎn)TNF-α誘導的關節(jié)軟骨細胞凋亡，提高細胞中SOD活性，降低NOS活性。

綜上，沉默PDCD5可能通過調(diào)控細胞內(nèi)氧自由基和NO合成水平影響骨關節(jié)炎軟骨細胞損傷，這為明確PDCD5在關節(jié)炎軟骨退行性病變發(fā)生中的作用奠定了基礎。