紫杉醇聚酰胺聚合物膠束制備及表征

王彥會 王瑩 趙文萃 張琦 趙慶蘭

(1吉林省肝膽病醫院，吉林 長春 130021；2解放軍九六四醫院；3江西中醫藥大學)

紫杉醇(PTX)從短葉紅豆杉的樹皮中分離得到而命名，其作用機制是具有獨特的抗微管作用，促進微管蛋白聚合及抑制微管的解聚，阻礙細胞內骨架合成，從而干擾有絲分裂〔1～5〕。它主要用于治療乳腺癌、卵巢癌及非小細胞肺癌等〔6～8〕。PTX是一種疏水性藥物〔9〕，因此，提高溶解性是PTX制劑的首要問題。目前，國內外市售PTX制劑中除注射用PTX脂質體(力樸素)為脂質體載體外，均為聚氧乙烯蓖麻油與乙醇作為溶媒制劑，其中聚氧乙烯蓖麻油具有腎毒性、變態反應和神經毒性等不良反應，應用受到很大影響。另外，PTX作為細胞毒性的抗腫瘤藥物，因為缺乏腫瘤靶向性，甚至導致全身性毒性〔10〕，特別是中性粒細胞減少癥等免疫性疾病，這使得其臨床應用受到很大限制。

本研究擬通過N-羥基琥珀酰亞胺-聚乙二醇(PEG)-馬來酰亞胺的羥基琥珀酰亞胺活化酯與聚酰胺聚合物(PAMAM)表面的伯氨基反應生成穩定的酰胺鍵實現PEG化，通過巰基與馬來酰胺基團的特異性反應將透明質酸(HA)耦聯到PEG的另一端。最后將PTX通過順式烏頭酸酐耦聯到PAMAM表面尚未反應的伯氨基上，進行載藥，通過以上設計得到葉酸(FA)/HA雙靶向PAMAM載藥系統，并對其體外性能進行評價。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器 十八胺、N，N-二甲基甲酰胺、甲酰胺、N，N-二環己基碳二亞胺、FA、HA、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺均購自麥克林；硼酸購自天津市恒興化學試劑制造有限公司；十水合四硼酸鈉、二甲基亞砜均購自國藥集團化學試劑有限公司；NH2-PEG2000-COOH、透析袋均購自北京索萊寶科技有限公司；PAMAM購自威海晨源分子新材料有限公司；PTX購自大連美侖生物技術有限公司。儀器為H-J磁力加熱攪拌器(鞏義市裕華儀器有限責任公司)，PH400基礎型酸度計(安萊利斯有限公司)，TY96-11IV超聲波細胞粉碎機(寧波新藝生物科技葛粉有限公司)，高速冷凍離心機(Thermo)，電熱鼓風干燥箱(上海博迅有限公司)，GOLD-SIM冷凍干燥機(美國金西盟國際集團)，透射電鏡(TEM)(日立)，動態光散射(DLS)(美國布魯克海文儀器公司)。

1.2PAMAM熒光標記物的制備 利用PAMAM的氨基末端與異硫氰酸熒光素的異硫氰基可以共價結合的化學反應，制備熒光標記物。稱取適量PAMAM，溶于磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)中，緩慢滴加異硫氰酸熒光素的丙酮溶液。摩爾比為PAMAM∶異硫氰酸熒光素=1∶1.2。避光磁力攪拌36 h，透析袋中透析3 d，離心除去未反應的異硫氰酸熒光素，凍干得到異硫氰酸熒光素標記的PAMAM聚合物。異硫氰酸熒光素在488 nm激發波長下，顯示特征綠色熒光。

1.3PAMAM-PEG的合成 稱取硼砂1.895 3 g、硼酸 1.235 7 g 溶于1 L蒸餾水中，得到pH8.0的緩沖溶液，避光保存。將PAMAM 2.079 6 g和PEG 0.141 0 g溶于20 ml硼砂-硼酸緩沖液中，室溫，避光，磁力攪拌12 h(轉速為1 000 r/min)。將反應混合物轉移至50 kD截留分子量的超濾管中超濾，轉速為4 000 r/min，30 min/次，共超濾7次，收集上層液體，放入-20℃冰箱冷凍保存，后放入冷凍干燥機中凍干，凍干后稱重、密封保存，備用。

1.4HA-C18的合成 稱取HA 100 mg，溶于甲酰胺20 ml，50℃水浴加熱，磁力攪拌(轉速為1 000 r/min)直至完全溶解，冷卻至室溫。加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽480 mg，N-羥基琥珀酰亞胺290 mg，冰浴磁力攪拌(轉速為1 000 r/min)2 h，充分反應，得到混合物1。稱取十八烷胺30 mg，溶于15 ml無水二甲基甲酰胺中，充分溶解后，緩慢滴加至上述混合物1中，兩者混合液在60℃氮氣環境下攪拌5 h，然后在氮氣環境下室溫攪拌24 h。將上述反應液轉移至透析袋中(截留分子量7 000 D)在水/乙醇(V/V，等容積比)1 000 ml中透析24 h，然后將透析過的上述混合液在蒸餾水中透析24 h。所得混合物離心除去不溶雜質，將所得液體放入-20℃冰箱冷凍保存，然后放入冷凍干燥機中凍干后稱重、密封保存，備用。

1.5FA-HA-C18的合成 稱取FA 102.3 mg，溶于30 ml二甲基亞砜中，使其充分溶解。稱取二環己基碳二亞胺92 mg，N-羥基琥珀酰亞胺33 mg，加入上述液體中，室溫避光活化反應5 h。將上述HA-C18用15 ml無水甲酰胺溶解，將FA-N-羥基琥珀酰亞胺-二環己基碳二亞胺濾液緩慢滴入上述含HA-C18的無水甲酰胺溶液中，避光，磁力攪拌(轉速為1 000 r/min)48 h。將反應后的FA-HA-C18反應液轉移至透析袋中(截留分子量7 000 D)在NAHCO3-NA2CO3緩沖液(NAHCO33.34 g和NA2CO31 g定容至1 L雙蒸水中)中透析24 h。將透析過的上述混合液，在蒸餾水中透析24 h。所得混合物離心除去不溶雜質，將所得液體放入-20℃冰箱冷凍保存，放入冷凍干燥機中凍干后稱重、密封保存，備用。

1.6PTX-PAMAM-PEG-FA-HA-C18膠束的制備 稱取PTX 50 mg，溶于2.5 ml無水乙醇中，用無水乙醇溶解的PTX緩慢滴加至FA-HA-C18的溶液中(FA-HA-C18凍干粉40 mg，以2.5 mg/ml濃度溶解于蒸餾水中)，磁力攪拌24 h，冰浴超聲10 min(超聲功率200 W，工作2 s，間歇3 s)，溶液于4 000 r/min離心30 min，上清液經過0.45 μm濾膜，得到FA-HA-PTX混合物。在上述混合液中加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，室溫避光反應12 h，加至PEG-PAMAM的水溶液中。用鹽酸調節pH值至8.0，室溫避光反應12 h。反應結束后，用蒸餾水透析，離心除雜質，將所得液體放入-20℃冰箱冷凍保存，放入冷凍干燥機中凍干后稱重、密封保存，備用。

1.7載PTX膠束中藥物含量測定 稱取3 mg載PTX膠束，加入3 ml乙腈，探頭超聲15 min(2 s，2 s)使得載體結構被充分破壞，過0.45 μm微孔濾膜，續濾液作為供試品溶液，用高效液相檢測PTX的含量。按公式計算載藥量及包封率。制劑的載藥量(%)=制劑中所含藥物重量/制劑總重量×100%；制劑的包封率(%)=制劑中所含藥物重量/投藥量×100%。

1.8載PTX膠束的表征 通過透射電子顯微鏡(TEM)觀察膠束的形態和分散度。通過動態光散射(DLS)〔垂直偏振He-Ne激光，十八角度激光散射儀(DAWN EOS)，散射角定為90°，檢測溫度為25℃〕觀察膠束的粒徑。

1.9載PTX膠束的穩定性考察 稱取3 mg載PTX膠束，加入3 ml乙腈，探頭超聲15 min(2 s，2 s)使得膠束的結構被充分破壞，過0.45 μm微孔濾膜，續濾液作為供試品溶液制備供試品，分別于0，1，2，4，6，8，12 h進樣，利用高效液相檢測PTX濃度，記錄其峰面積。

1.10載PTX膠束的體外釋放行為考察 采用透析袋擴散技術來測定載藥制劑的體外釋放情況，以pH7.4 PBS + 0.1% 十二烷基硫酸鈉作為釋放介質，選用截留分子量為10 000的透析袋，使得釋放出的游離PTX可以透過透析袋進入到PBS中，通過測定釋放介質中的PTX含量來初步評價釋藥情況。稱取載藥制劑3 mg，加入5 ml透析介質(pH7.4 PBS + 0.1% 十二烷基硫酸鈉)溶解后，轉移至透析袋(截留分子量為10 000)中，透析袋兩端扎緊，浸入20 ml透析介質中，于(37±1)℃下，100 r/min振蕩。分別在0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0、36.0、48.0、72.0、96.0 h吸取透析液1 ml，同時補充1 ml同溫度的透析介質。利用高效液相法檢測并計算PTX含量，再按公式計算累積釋放百分率。累積釋放百分率(%)=CV×100%/制劑中所含PTX量；C：時間點的樣品濃度，mg/ml；V：時間點的釋放介質體積。

2 結 果

2.1PTX-PAMAM聚合物的表征 用磁共振氫譜(1H-NMR譜)對合成所得產物的結構進行表征，PTX、PAMAM-PEG、FA-HA-C18的特征峰說明成功地將三組分引入到PTX-PAMAM-PEG-FA-HA-C18結構中。見圖1。

圖1 產物的1H-NMR譜

2.2載PTX膠束的生化表征 膠束的PTX載藥量為18.50%，包封率為50.13%。圖2可見，膠束為結構規整、分散性好、粒徑較均一的球形膠束。另外，從DLS測定結果中，還可得出膠束的平均粒徑約為329 nm。

圖2 載PTX膠束的TEM

2.3載PTX膠束的穩定性 將膠束加入乙腈中，探頭超聲使得膠束結構被充分破壞，過微孔濾膜，分別于0，1，2，4，6，8，12 h收集續濾液，記錄其峰面積分別為3 672 301.750、3 532 999.750、3 618 709.750、3 560 782.875、3 568 750.025、3 626 341.438、3 545 328.250 μV·s，平均3 589 316.263 μV·s，相對標準偏差(RSD)為1.41%。在12 h內峰面積穩定，表明膠束穩定性較好。

2.4載PTX膠束的體外釋放 前6.0 h之內，PTX從膠束中釋放較快，載藥制劑累積釋放百分率為0.5 h 2.07%、1.0 h 8.43%、2.0 h 18.60%、4.0 h 25.02%、6.0 h 49.13%，8.0～96.0 h內釋放緩慢，8.0 h 69.81%、12.0 h 78.45%、24.0 h 88.14%、36.0 h 94.02%、48.0 h 96.71%、72.0 h 96.85%、96.0 h 97.01%。充分體現了高分子聚合物膠束的緩釋效應。

3 討 論

分子物質和脂質在腫瘤組織透過性增強及滯留效應稱作實體瘤的高通透性和滯留效應(EPR)〔11～13〕，EPR促進了大分子類物質在腫瘤組織的選擇性分布，可以增加藥效并減少系統副作用，本研究基于EPR原理，將高分子聚合物與小分子化療藥物的耦聯物，通過藥劑學手段結合到高分子材料表面。PAMAM是一類目前得到廣泛應用的樹枝狀聚合物材料〔14〕，其本身能物理包埋或化學結合小分子藥物，其表面的官能團還能連接多種對機體某些器官、組織和細胞有特異性相互作用的靶向配基，從而將包封或者耦聯的藥物帶到病變部位實現主動靶向治療。PEG具有優良的親水性〔15〕，且無毒，無免疫原性。PEG化是藥物制劑中常用的手段〔16，17〕，對于PAMAM聚合物，PEG化不僅可降低載藥系統的毒性，而且可進一步提高載藥系統的分子量和親水性〔18〕，從而減少網狀內皮系統的攝取，延長血液中的滯留時間，增強EPR，實現對腫瘤的被動靶向作用。本研究成功地將PTX、PAMAM-PEG、FA-HA-C18三組分引入到PTX-PAMAM-PEG-FA-HA-C18結構中；并獲得高載藥量、高包封率、結構規整、分散性好、粒徑均一、穩定性較好的膠束，有效地緩解了傳統納米粒的突釋效應，具有獨特的優勢。本研究采用了對PAMAM進行PEG化的思路，也為主動雙靶向修飾提供了可行的途徑，這種方法是很有前景的，值得深入研究。